分离和鉴别转基因单克隆细胞的方法

稳定转染后，要想得到外源基因整合到宿主细胞染色体组中，并能稳定表达靶基因的单克隆细胞，需要在带有抗生素的选择培养基中对多克隆进行有限稀释法的分离培养，丝裂霉素 C 处理的饲养细胞对单个细胞的营养和支持作用十分关键，然而个别饲养细胞在培养过程中可能复燃从而混入单克隆细胞中，导致单克隆分离扩增的失败。而传统的单克隆检测需要设计多对覆盖外源基因结构片段的引物，多次重复进行提取核酸再做 PCR、电泳等，耗时费力。本文针对以上关键步骤进行改良优化，利用无饲养细胞(nofeeder cells)的改良分离培养基进行了单克隆的分离和培养，并结合荧光素酶报告基因快速检测法，从多克隆中迅速有效的筛选出转染成功的单克隆。本文中介绍的稳定转染(电穿孔法)后单克隆细胞的筛出策略大大提高了检出效率，缩减时程和耗材，减免了多次重复筛选的人力物力。改良法有效缩短实验研究周期，能为临床和科研提供简捷可靠的单克隆纯化和鉴定的手段，以下进行详细介绍。

1 方法与步骤

本研究使用悬浮生长的 T 淋巴细胞系Jurkat 做为转基因靶细胞，利用电穿孔稳定转染法的高电压 (270 V 电压，950μF 电容和 0.4 cm 的放电杯，Bio RAD 电穿孔仪)将外源人工合成的质粒导入 Jurkat 细胞中，经过约1w 的含抗生素分离培养基(潮霉素 Hygrimycin B 浓度为 40μg/ml)的筛选培养，初步得到整合有携带抗性基因标记质粒的多克隆细胞，而将外源基因未整合入基因组的不稳定转染的细胞多数筛除。将细胞计数并利用有限稀释法稀释，一传统组含有丝裂霉素C(40μg/ml，30 mins，Sigma)处理的悬浮Jurkat 饲养细胞浓度为 1.5×104/ml，96 孔培养板中每孔含约 200 μl 加有饲养细胞的选择培养基并含有一个候选靶细胞，其中 16 个对照孔不含候选单克隆细胞，每板设置8 孔阴性对照为未加有丝分裂原处理的原始细胞，培养过程中由于潮霉素的作用一直缓慢平稳增殖，而另外8 孔加入致死量高浓度丝裂霉素 C 处理的 Jurkat 做阳性对照，培养过程中会提前全部凋亡，阴阳对照做为饲养细胞的生长参照。另一改良组培养基无饲养细胞成分，培养基来自一天前换液传代的同种 T 淋巴细胞的离心后(1500 rpm，10min)的培养上清，当时其上清供体细胞的浓度为 1.5×105/ml。两组培养板每 2 天半量换液 100 μl，传统组使用新鲜配制的RPMI-1640(Sigma，10% FCS)悬浮细胞专用培养基，新鲜加入潮霉素B 至 40μg/ml，改良组仍然加入含有等量抗生素浓度的离心后细胞的培养上清100 μl。显微镜观察两组细胞培养的各孔，直到发现分裂增殖的细胞克隆，多数孔单细胞凋亡，将发现的存活并扩增成功的单细胞分别渐次移入48 孔、24 孔、6 孔培养板和25 cm 培养瓶中，逐步扩增数量。荧光素酶报告实验的基础是转入T 淋巴细胞的外源质粒表达的是含有 GAL4 的融合蛋白能够与荧光报告质粒上的 GAL4 结合位点作用启动荧光素酶的表达，因此只要细胞荧光活性增强则表明荧光素酶的启动子被激活，细胞中成功转染了特定标签的外源基因，荧光素酶与底物反应产生的荧光素可用 Luminometer 检测与待测外源蛋白的作用强度成正比。将扩增好的候选的多个单克隆、转染靶基因的多克隆及空白对照的 Jurkat 细胞用pFR-Luc 荧光质粒进行 DEAE- 葡聚糖介导法转染，在荧光测定仪上检测 100μl 荧光报告裂解缓冲液(Promega)的荧光活性，用蛋白含量(Beckman DU640，750nm)校正得到相对荧光活性单位。对比二者方法的单克隆得率%，同时对只含有 Feeder 的阴阳对照培养孔观察分析，是否两周时间全部凋亡或仍然稳定增殖中，来判断培养条件是否稳定有效。

2 结果与分析

2.1 传统法和改良法的独立三次单克隆化存活细胞克隆比较

对传统法和改良无饲养细胞法分离单克隆的可操作性进行比较，进行了三次独立的培养，如方法与步骤中介绍，首先用电穿孔法稳定转染靶基因质粒进入 T 淋巴细胞系Jurkat，经过一周抗性筛选在潮霉素分离培养基中初步得到存活的多克隆细胞。有限稀释后在96 孔板中培养，传统的饲养细胞法每 96 孔板设立 8 个阴性和 8 个阳性对照，改良的无饲养细胞法每个 96 孔板中设立 8 个孔为阴性对照，换液时只添加含选择抗生素的RPMI-1640 培养基，非含丰富细胞刺激生长因子的无细胞培养上清。因此第一次培养传统法 3 块 96 孔板含单细胞孔为240 个，第二次5 块96 孔板400 个，第三次6 块96 孔板480 个;而相应的改良法则第一次培养传统法 3 块 96 孔板含单细胞孔为 264 个，第二次5 块96 孔板440 个，第三次6 块 96 孔板528 个。每日观察孔中是否有细胞和细胞分裂情况，记录并编号。两周后将增殖成团的细胞依次移入 48 孔、24 孔、6 孔培养板和25 cm 培养瓶中，逐步扩增数量，进入48 孔扩增后传统组也无需饲养细胞。以最终能在 25 cm 培养瓶中的选择培养基中正常增殖的细胞计算成活率。

根据表格数据显示，无饲养细胞存在，单个细胞在含有生长刺激因子的培养上清中也能增殖分裂，且成活比率较高，而对照8 孔中用普通分离培养基(含潮霉素)换液的单个细胞全部凋亡。可见悬浮的单个T 淋巴细胞对细胞生长刺激因子依赖较强而对细胞密度依赖较低。饲养细胞组阴性对照孔仅有用丝裂霉素 C 处理的细胞不含单个靶细胞，两周后个别孔仍有细胞增殖，阳性致死量100μg/ml 处理的饲养细胞在一周内全部凋亡。总的成活率传统法和改良法分别为5.27% 和4.55%，统计软件SPSS 11.5 分析(P=0.417)无显著差异。而单个细胞扩增成活的克隆未必是单克隆，可能是复燃的饲养细胞形成的假克隆或单克隆与假克隆的混合体(根据观察到的仅有饲养细胞的对照孔培养两周后，在 96 孔板中 5% ～ 8% 的 feeders 孔仍然存活)，或不完整整合的突变细胞克隆，这要通过以下步骤鉴别。

2.2 未整合细胞克隆、多克隆和单克隆鉴别：存活细胞的荧光素酶报告基因实验两组(传统法和改良法)存活并扩增成功的细胞克隆在培养瓶中增殖，取各瓶中2×106 个细胞，用 DEAE- 葡聚糖瞬时转染法，将10 μg pFR 报告 LUC 质粒转染入，从报告裂解液中获取 LUC 蛋白荧光，测量底物激发信号 20 s，原始荧光活性经过 750 λ 波长蛋白浓度的校正得到相对荧光活性。未整合细胞克隆、多克隆和单克隆的荧光信号依次递增，差异显著。因此根据相对荧光活性单位数值判断未整合细胞克隆、混合多克隆和单克隆简单快速。荧光报告质粒的结构原理和由此进一步筛选出的含有靶基因中标记融合基因 GAL4 的单克隆比率。

2.3 稳定转染外源基因的单克隆细胞的分离鉴别策略流程。电穿孔稳定转染后的多克隆，有限稀释后用饲养细胞或无饲养细胞法分离单克隆，再用荧光素酶实验鉴定标记基因的表达，再提取DNA 做引物PCR 鉴定重要区域片段的存在，得到完整整合靶基因的单克隆进一步通过 RNA 逆转录PCR 确定其转录水平或免疫印迹(WB)/免疫细胞组化 ICC 等方法确认蛋白的表达，单克隆分离鉴定策略的简易流程。

3 结论

无饲养细胞法分离增殖的单克隆策略有效避免了支持作用的饲养细胞复燃污染混入单克隆中，从而针对饲养细胞可能的优势增生后果，进行有效预防，利用同种非转染细胞培养上清中含有多种生长因子的滤液能有效刺激单细胞生长的原理进行单克隆培养，换液和扩增，该法去除了饲养细胞的繁琐制备步骤，不必有丝分裂抑制剂处理和对其浓度的优化探索，节约了试剂和时间，最终分离到纯化的单克隆。荧光素酶报告基因实验根据相对荧光活性单位的显著差异，对靶基因携带的荧光标记蛋白的表达进行区别确认，从而有效区分了为转染细胞、多克隆和单克隆细胞。只需对少数的候选单克隆进行的特异引物PCR、电泳和WB[5]，则可明确靶基因稳定完整的存在并表达于筛选的单克隆细胞中。该方法省时省力、简便快捷，特别是缩减了大批量提取核酸及多次 PCR 和电泳的时间和耗费，优化了筛选流程，为临床、基础科研缩短时程、提高效率提供了有益的改良方案。

4 讨论

在体外的细胞培养中，单个的或数量很少的细胞不易生存与繁殖，必须加入其它活的细胞才能使其生长繁殖，这种饲养细胞往往用转染前的同种细胞经过丝裂霉素C 或紫外照射处理，抑制其增殖，在两周左右的单克隆筛选培养基中逐渐凋亡。而含有抗生素抗性基因的单个靶细胞克隆则在饲养细胞分泌的细胞因子和 Feeder 提供的细胞间信息交流的刺激下不断扩增。改良的无饲养细胞法从正常细胞培养上清中离心过滤得到无细胞的培养基，含有刺激细胞分裂的有效因子成分，能有效避免非靶细胞的污染和有丝分裂抑制剂处理后药物残余或非转染细胞的复燃和混入，从而得到纯化的单克隆细胞。

3 次培养总的存活率传统饲养细胞法略高于改良无饲养细胞法(5.27% VS 4.55%)，可能与单个转染细胞对细胞密度的一定依赖性和Feeders 提供更全面的刺激信号有关，个别Feeders 细胞在培养基中逐渐复燃，而丝裂霉素C 处理后细胞虽然经过清洗，但极微量的残余也可能影响单细胞的扩增，因此比率只略高而无显著差异。

荧光素酶法报告基因鉴别法，简单快速，荧光信号强，结果明确。再辅助以多对关键靶基因片段的引物 PCR 实验，结合 RNA 逆转录 cDNA 的 PCR 检测和免疫印迹确认蛋白表达能准确有效的筛选出目标单克隆。本文总的单克隆的分离比例低于 0.8%，如从换液的成分、比例和选择抗生素的浓度进一步优化，可能提高单克隆的得率，还需继续优化探索筛选的策略。遗传背景一致的单克隆细胞对外源基因或蛋白高表达稳定而持久，后续实验中应用方便结果可重复性好、富有说服力，在分子遗传、蛋白质组学等领域有广阔应用前景。