Calcein-AM/PI双染法与流式细胞术检测γδT细胞毒性结合

γδT 细胞是一群桥接固有免疫和适应性免疫的独特T 淋巴细胞亚群，约占外周淋巴细胞的0.5%~5%，在机体抗感染和抗肿瘤免疫中发挥重要作用。最近研究发现，γδT细胞在难治性前列腺癌、肾癌、非小细胞肺癌、多发性骨髓瘤、转移性黑色素瘤、白血病和淋巴瘤的临床治疗中总客观应答率达40%，其中难治性前列腺癌和肾癌的客观应答率优于二线化疗药。虽然取得了很好的临床效应，但缺乏一种准确、简单、经济的方法评估其杀伤效应，该方法的建立对推进免疫细胞临床应用标准化质量体系的建设具有重要意义。免疫细胞细胞毒活性经典的检测方法是51Cr释放法，由于放射性元素污染，极大地限制了该方法的应用。其它检测方法如MTT法、乳酸脱氢酶(LDH)释放法，存在灵敏度不高、操作繁琐的缺点。最近研究发现，用钙黄绿素-AM(Calcein-AM)染色效应细胞，检测前用碘化丙啶(propidium iodide，PI)对死亡细胞染色，最后用流式细胞仪(flow cytometry，FCM)检测，具有与51Cr 释放法相当的准确性。然而经典方法无法区分死亡细胞的来源：即来源于免疫细胞介导的杀伤还是自然死亡。因此我们通过实验，建立并优化了Calcein-AM/PI 双标法结合流式细胞术检测γδT细胞杀伤性的方法，解决了上述方法的不足。

1 材料与方法

1.1 主要试剂和仪器

Calcein-AM 购自Invitrogen，PI、HMBPP 购自Sigma，RPMI 1640、胎牛血清(FBS)购自Gibco，重组人IL-2(rhIL-2)购自北京双鹭，硫酸庆大霉素购自宜昌人福药业，人淋巴细胞分离液购自天津灏洋。抗CD3-FITC、抗CD3- PerCP、抗CD4-PE、抗CD8-PE、抗TCRVγ9-PE 荧光抗体和Trucount管购自BD。流式细胞仪FACSCanto II和Z2全自动细胞分析计数仪分别购自BD和Beckman。

1.2 标本来源和γδT细胞培养

采集健康成年志愿者外周静脉血，肝素抗凝，生理盐水等体积稀释后，Ficoll 密度梯度离心法分离获取外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMCs);充分洗涤后调整细胞数为1×106/ml，重悬于含5% FBS、5%人自体血浆和80 IU/ml硫酸庆大霉素的RPMI 1640完全培养基中。接种于T25培养瓶，每瓶5 ml，同时加入HMBPP和rhIL-2，终质量浓度均为20 ng/ml，根据细胞生长情况每2~3天进行补液或传代，补液使用含有300 IU/ml rhIL-2的RPMI 1640完全培养基，补液后细胞数维持在(0.5~1)×106 /ml，培养至7~10 d收集细胞，经上述条件处理可获得γδT细胞。肿瘤细胞株K562 和A549 均购自中国科学院上海细胞库，用含有10% FBS的RPMI 1640培养基于37 ℃、5% CO2 培养箱内培养。

1.3 Calcein-AM 标记靶细胞Calcein-AM 以二甲基亚砜(DMSO)配制成储存液(2 mmol/L)，分装后-20 ℃ 保存。不同的肿瘤细胞有不同的染色条件，为了确定染色条件，取对数生长期的K562、A549细胞，PBS洗涤2 次后调整细胞数为4×106/ml，添加于24孔板，每孔1 ml;将倍比稀释的Calcein-AM加入上述细胞孔，终浓度分别为1、0.5、0.25、0.125、0.0 625、0.0 313、0.0 156、0.0 078 μmol/L，每一梯度设3个复孔，然后于37 ℃、5% CO2培养箱内孵育30 min;孵育结束后，用含10% FBS的RPMI 1640培养基洗涤2次，制备成1×105/ml细胞悬液，分别于0、4和24 h上机检测MFI值。固定Calcein-AM浓度为0.5 μmol/L，调整细胞数分别为5×104/ml、1×105/ml、2×105/ml、4×105/ml、8×105/ml、1.6×106/ml、3.2×106/ml、6.4×106 /ml、1.28×107/ml，然后按照上述步骤进行染色、洗涤和检测MFI值。

1.4 细胞收集、PI 染色和流式检测标准操作程序将Calcein-AM 标记好的肿瘤细胞与γδT细胞按1∶10的比例制备成细胞数分别为1×105/ml、1×106/ml的混合细胞悬液，加入24孔培养板，1 ml/孔;同时设置阴性对照组，含1×105 /ml Calcein-AM 标记的肿瘤细胞，1 ml/孔。每组均设置3 个复孔，于37 ℃ 5%CO2培养箱内共孵育30 min。孵育结束后，取出细胞充分重悬后移入2 ml EP 管内，然后用PBS 洗涤1 次，洗涤液移入对应EP管内，并用PBS调整每管的体积为2 ml。上述细胞悬液充分重悬后取450 μl于新的EP管内，加入终质量浓度为5 μg/ml的PI 染色，避光、冰浴20 min 后移入经抗CD3-FITC、抗CD4-PE 同型对照抗体染色的体积为500 μl 的绝对计数管内。上机检测，按固定体积100 μl 收集计数。

1.5 γδT细胞介导的细胞毒效应检测Calcein-AM标记好的肿瘤细胞(K562、A549)，2×105/ml，0.5 ml/孔加入24孔培养板，然后按照不同的效靶比(5∶1、10∶1 和20∶1)将γδT细胞加入上述培养板孔内，最后用完全RPMI 1640培养基补充至1 ml/孔;同时设置阴性对照组，含1×105 /ml Calcein-AM 标记的K562和A549 细胞，体积为1 ml，每组均设置3 个复孔，于37 ℃，5% CO2 培养箱内共孵育24 h。按照1.4 操作程序，进行细胞收集、PI 染色和流式检测，最后用FlowJo 软件对结果进行分析，γδT细胞杀伤率计算公式为：1-实验组Calcein-AM 单阳性细胞数/对照组Calcein-AM单阳性细胞数。

1.6 统计学分析

数据采用均数±标准差，采用t 检验、单因素方差分析或简单线性回归分析完成相关数据分析。P<0.05 认为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Calcein-AM 工作浓度与靶细胞密度相关性分析流式检测不同Calcein-AM 浓度对肿瘤细胞(K562、A549)染色平均荧光强度(mean fluorescenceintensity，MFI)的影响。结果显示，A549和K562在不同浓度Calcein-AM标记的肿瘤细胞均能显示一个单一的峰值，MFI随Calcein-AM 浓度升高而增强。进一步简单线性回归分析显示，A549和K562的MFI 与Calcein-AM 浓度呈线性正相关(R2 =0.971 0，P<0.000 1)。在此基础上，我们进一步探讨了Calcein-AM标记的肿瘤细胞与细胞密度的相关性。Calcein-AM的工作浓度为0.5 μmol/L，以K562为例，设定K562细胞数分别为5×104/ml、1×105/ml、2×105/ml、4×105/ml、8×105/ml、1.6×106/ml、3.2×106/ml、6.4×106/ml、1.28×107/ml。结果显示，Calcein-AM 对不同细胞数K562 也均显示一个单一的峰值，不同的是MFI 随K562密度的增加而降低。简单线性回归分析显示，MFI与K562密度呈线性负相关(R2= 0.476 7，P<0.000 1)。

2.2 靶细胞平均荧光强度时间动力学变化特征性分析为了研究Calcein-AM标记的K562 MFI 是否随时间变化，将染色的K562分别0、4和24 h上流式检测。结果显示，随着染色时间延长MFI逐渐降低，3组之间差异均有统计学意义(P<0.001)。此外，我们还检测了Calcein-AM染色对细胞活率是否产生影响，利用PI检测实验组与对照组细胞死亡比例。结果显示，与对照组相比，死亡率差异无统计学意义(P>0.05)。

2.3 流式细胞仪计数准确性和稳定性分析在上述实验的基础上，我们应用抗CD3-PerCP 和抗CD4-PE的同型对照抗体对标准磁珠进行染色，绝对计数管原理是计数管的Beads数量是已知，当固定上样体积时，即可知Beads的浓度。流式可以记录颗粒数，上样后机器根据颗粒数量算上体积，从而计算出样本的浓度，进一步对流式收集细胞过程的稳定性和计数的准确性进行验证。结果显示，标准磁珠和Calcein-AM 标记的活细胞群分群明显，经BD绝对计数管计数和给定值之间差异无统计学意义(47 200±208 vs 47 150，P=0.324>0.05)。同时，经孵育30 min的实验组和对照组Calcein-AM 标记的肿瘤细胞绝对计数差异无统计学意义(98 642±876 vs 98 692±769，P=0.698 7>0.05)。

2.4 γδT 细胞对Calcein-AM标记靶细胞杀伤功能检测利用上述优化条件，我们评估了不同效靶比下，γδT细胞与K562和A549细胞共孵育24 h的杀伤活性。结果显示，效靶比分别为5∶1、10∶1、20∶1条件下，K562 杀伤率分别为0.63±0.02、0.84±0.02、0.91±0.02，与5∶1组相比，10∶1、20∶1组杀伤率明显提高(P<0.01)，但是10∶1和20∶1组之间杀伤率无统计学意义(图4);A549杀伤率分别为0.38±0.02、0.5± 0.02、0.65±0.02，与5∶1组相比，10∶1、20∶1组杀伤率明显提高(P<0.01)，但是10∶1和20∶1组之间杀伤率无统计学意义。因为不同的肿瘤细胞，γδT的杀伤有不同的结果，从上述结果来看，对血液瘤的杀伤率就比实体瘤的要高。

3 讨论

近年来，以免疫细胞为基础的肿瘤免疫治疗在临床应用中取得了巨大进展。如何通过一种简单的方式、准确评价其细胞毒活性，则对免疫细胞临床应用质量检测标准化体系的建设相当重要。测定免疫细胞细胞毒活性最经典的方法是51Cr 释放法。该方法准确且重复性好，但存在很多不足，如51Cr本身的放射性污染、自发释放率高以及检测需要大量的免疫细胞等内在缺陷，使其应用受到了极大限制。目前产生了很多51Cr释放法替代性方法，其中基于流式细胞术的Calcein-AM/PI双染法取得了很好的效果。Jang 等报道采用Calcein-AM对NK细胞染色检测其细胞毒活性，流式检测前用PI染色，结果与51Cr释放法检测近似。该方法直接通过死亡细胞占总靶细胞的百分比来计算杀伤效应，无法区分死亡细胞是自然死亡还是NK细胞介导的杀伤性死亡。因此，该方法尚存在一定的局限性。

本研究成功建立并优化了基于流式细胞术的Calcein-AM/PI双染法检测γδT细胞杀伤效应。选择K562和A549作为靶细胞，首先确定了Calcein-AM工作浓度和靶细胞密度，在0.1~0.5 μmol/L的浓度范围内有很好的线性关系，浓度为0.5 μmol/L时，靶细胞有较宽的密度范围选择。因此，本实验为应用Calcein-AM进行不同密度靶细胞染色提供了参考。接着研究时间对靶细胞MFI变化以及Calcein-AM对靶细胞存活的影响，发现MFI随时间延长而降低，而染料本身对细胞存活无明显影响，这与以前的报道相一致[16, 19]。同时本研究还发现，通过优化染料浓度和靶细胞密度，染色24 h后还能很好的与未染细胞区分，较Cholujova等染色后需3~4 h内检测，时间有明显延长[19]。因此通过本优化方案，可以使效靶细胞共孵育时间延长到24 h，从而更加有效的反应效应细胞对靶细胞的杀伤效应。另外，本研究通过BD绝对计数管验证了流式操作过程的稳定性和准确性，绝对计数管原理是：根据计数管已知的Beads数量，当固定上样体积时，即可知Beads的浓度。流式可以记录细胞的颗粒数，上样后机器根据颗粒数量和体积，从而计算出样本的浓度，进一步对流式收集细胞过程的稳定性和计数的准确性进行验证。本实验选择染色后30 min检测对肿瘤细胞计数，是因为30 min细胞能够很好的贴壁，同时对靶细胞的杀伤效应还未显示。因此能够很好的模拟效靶细胞共孵育更长时间的贴壁状态，从而更好的验证收集、PI染色和上流式操作的程序。

最后在上述优化的条件下，检测了诱导培养第10 天γδT 细胞对K562 和A549 细胞的杀伤效应。γδT细胞是PBMCs经HMBPP和rhIL-2联合诱导培养的一群以Vγ9Vδ2 T细胞为主的细胞群，增殖力高达1 000倍(数据未显示)。流式检测后，通过先计算靶细胞存活率，然后用“1-存活率”的方法间接计算其杀伤率，发现共孵育24 h，不同的肿瘤细胞有不同的杀伤效率，对于K562细胞，当效靶比为5∶1时即可检测到明显的杀伤效应，10∶1时，杀伤率就高达90%以上，而对于A549细胞，当效靶比为5∶1时杀伤率为38%，10∶1，20∶1是额杀伤分别达50%和60%以上(图4、5)。因此我们建立一种高效扩增、并具有高细胞毒活性的γδT 细胞培养方案;通过本方法能够很好的对其细胞毒活性进行检测。由于使用对照的方式排除了反应过程中自然死亡细胞，因此更能真实反应γδT细胞的细胞毒活性。同时由于国内条件限制未能和51Cr释放法作对比分析，仅通过对整个检测流程验证的基础上来建立。