Daxx对K562细胞向巨核细胞分化的抑制作用

白血病是严重危害人类生命健康的血液系统恶性肿瘤，其生物学特征表现为细胞增殖失控、分化成熟受阻、正常凋亡过程发生障碍，因而导致分化异常细胞大量增殖。抑制白血病细胞增殖、促进白血病细胞分化和凋亡，是治疗白血病的基本途径。死亡结构域相关蛋白(deathdomain-associatedprotein，Daxx)是一种受体胞浆死亡结构域结合蛋白，在凋亡、转录调控、病毒感染等方面发挥重要作用。Daxx可以通过结合DNA结合转录因子、E2A、Ets-1、Pax3和Pax5等参与基因表达的调控，Pax和Ets转录因子均和多种类型细胞的分化活动有关，Daxx可能通过影响转录因子来调控细胞分化。Daxx通过结合转录因子E2A，抑制E2A的功能，进而抑制肌细胞生成，参与肌细胞分化过程。Daxx基因在白血病细胞中广泛表达，人急性白血病(acuteleukemia，AL)、慢性淋巴细胞白血病(chroniclymphocyticleukemia，CLL)及其它恶性血液病细胞内均可见Daxx表达。而Daxx在这些血液病中的具体作用机制，目前研究不多。Daxx在白血病细胞中的广泛表达，是否与白血病细胞的分化有关，目前未见相关报道。本实验以K562细胞为研究对象，初步研究Daxx与K562细胞向巨核细胞分化是否存在相关性。

材料和方法

1主要试剂

K562细胞株由嘉兴学院医学院提供;DMEM培养液和新生牛血清购于HyClone;Daxx购于Sigma;G418购自Amresco;兔抗CD41和CD61购自BD;辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG和硝基四氮唑蓝(nitrobluetetrazolium，NBT)购自杭州昊鑫生物科技有限公司;RNA逆转录试剂盒和荧光定量PCR试剂盒购自东洋纺生物科技有限公司;蛋白marker购自Thermo;Lipofectamine2000购自Invitrogen。

2主要方法

2.1细胞培养K562细胞株由本室保存，常规传代培养。采用含有10%胎牛血清的DMEM培养基培养。

2.2稳定过表达Daxx的K562细胞系(Daxx-K562)的建立取对数生长期K562细胞接种于6孔板中，每孔用50μL无血清DMEM培养基稀释1μgGFPDaxx质粒和GFP-空载质粒(GFP-Daxx质粒和GFP-空载质粒由嘉兴学院潘巍巍博士提供);采用50μL无血清DMEN培养基稀释1μLLipofectamine2000，混匀静置5min;将质粒与Lipofectamine2000混合后室温静置20min，分别接种于培养板。置于37℃、5%CO2培养箱中48h，荧光显微镜观察表达情况。换液，加G418后继续培养。G418筛选2周后，有限稀释法获得单个荧光表达细胞，继续培养，建立GFPDaxx-K562细胞。

2.3实时荧光定量PCR实验TRIzol法提取各组总RNA，按试剂盒步骤逆转录后，选用10μL体系进行荧光定量PCR。反应条件:95℃5min;95℃30s，55℃30s，72℃40s，40个循环。

2.4CCK-8法检测细胞活力在96孔板中接种GFP-Daxx过表达组细胞和对照组细胞悬液，培养24h后，每孔加入10μLCCK-8，37℃孵育2h，酶标仪测定450nm波长附近的吸光度。每组4个复孔，重复3次。

2.5流式细胞术收集佛波酯(phorbol12-myristate13.acetate，PMA)处理72h后的GFP-Daxx过表达组和对照组细胞，连同PMA未处理组细胞，PBS洗2遍，收集10000个细胞，PBS稀释到50μL重悬细胞后加入1μLPE标记CD61抗体或CD41抗体，室温避光静置30min，预冷PBS洗涤2次后上机检测。

2.6NBT还原实验取经PMA作用72h后的GFPDaxx过表达组和对照组细胞，与2g/L的NBT溶液混合，37℃孵育30min后离心涂片，Giemsa染色，光学显微镜下观察胞质内含蓝灰色颗粒的阳性细胞。

2.7Westernblot实验收集细胞，预冷PBS洗涤3次后加入RIPA细胞裂解液，冰上放置30min，4℃13000×g离心30min，收集上清，BCA法蛋白定量。取30μg总蛋白进行SDS-PAGE，电转移至PVDF膜上，5%脱脂奶粉室温封闭1h。后加入相应I抗4℃孵育过夜，加II抗室温孵育2h。最后用ECL显色试剂盒于暗室曝光显影。

3统计学处理

用SPSS16.0统计软件进行分析。数据均采用均数±标准差(mean±SD)表示，多组间比较采用单因素方差分析(one-wayANOVA)，组间两两比较采用Bonferroni校正的t检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

结果

1过表达Daxx的K562细胞系的建立

荧光显微镜观察结果表明，GFP-Daxx在细胞内聚集，并表达于细胞核。实时荧光定量PCR检测过表达细胞系Daxx的mRNA水平显著高于对照组，Westernblot结果显示，过表达Daxx的K562细胞中，Daxx蛋白表达明显升高。

2过表达Daxx对K562细胞活力的影响

CCK-8实验结果显示，过表达Daxx后K562细胞的活力明显低于对照(K562细胞)组(P<0.01)。

3PMA诱导K562细胞向巨核细胞分化

流式细胞术分析结果显示，PMA处理K562细胞后CD41和CD61的表达升高，见图4。Westernblot实验结果显示，在PMA诱导K562细胞分化的过程中，p-ERK的蛋白水平升高，Daxx的表达呈下降趋势。

4过表达Daxx对K562细胞向巨核细胞分化的影响

过表达Daxx后，PMA诱导GFD-Daxx-K562细胞向巨核细胞分化，流式细胞术检测CD41和CD61的表达均明显低于对照(K562细胞)组(P<0.01)。NBT还原实验结果显示，Daxx过表达后，分化细胞数量与对照组相比明显降低(P<0.05)。Westernblot结果显示，过表达Daxx后，p-ERK的蛋白水平相对于对照组下降。

讨论

Daxx最初发现它是一种受体胞浆死亡结构域结合蛋白，之后证实它是一种定位于细胞核亚核结构早幼粒细胞白血病蛋白(promyelocyticleukemiaprotein，PML)癌基因结构域(PMLocogeneicdomains，PODs)的核蛋白。Daxx广泛分布于哺乳动物和人正常组织细胞及肿瘤细胞中，在凋亡、转录调控、病毒感染等方面发挥重要作用。作为一种重要的信号分子，Daxx可以在细胞质介导肿瘤坏死因子受体(tumournecrosisfactorreceptor，TNFR)超家族成员促凋亡信号的转导，在细胞核也可以作为转录调控因子，在转录调控中行使转录抑制或转录激活双重功能，通过转位、化学修饰、染色体调节、直接与转录因子或转录相关蛋白相互作用等多种方式发挥转录调控作用。Daxx广泛分布于哺乳动物和人的正常细胞及肿瘤细胞，在血液病中广泛表达，作为Fas受体胞浆死亡结构域结合蛋白，Daxx可以经Fas-Daxx-ASK1-JNK通路发挥促凋亡的作用;Daxx也可以发挥抗凋亡作用，在Daxx基因缺失的小鼠中，其胚胎干细胞发生凋亡，不能正常发育。Daxx可以结合转录相关蛋白或相关因子，如E2A、Ets-1、Pax3和Pax5等，进行转录激活或转录抑制的调控。

有研究表明，Daxx参与细胞分化，Daxx通过结合转录因子E2A，抑制E2A的功能，从而抑制关键的肌原性基因表达和减少肌小管的形成，抑制肌细胞生成，参与肌细胞分化过程;Daxx可以促进卵巢癌细胞的生长以及其化疗耐药性，Daxx可以通过抑制自噬促进前列腺癌的发生。关于Daxx在血液肿瘤中的作用，相关研究较少。

人白血病K562细胞株是慢性粒细胞白血病的一个典型的细胞系，其在体外被相关药物诱导后具有向巨核系、单核系或红系等多个方向分化潜能。K562细胞可以作为巨核细胞系分化模型，PMA是蛋白激酶C(proteinkinaseC，PKC)的激动剂，K562细胞能被PMA诱导分化成为具有巨核系特征的细胞。PKC是一类丝/苏氨酸蛋白激酶，参与多种信号转导途径，在细胞生长、分化和细胞因子分泌等过程中发挥着重要作用，ERK是经典MAP信号转导分子，介导多种细胞生物学过程，包括细胞生长、存活、分化和炎症反应等。PMA诱导K562细胞向巨核细胞分化过程中，ERK信号通路通常被激活。目前研究表明，影响PMA诱导K562细胞向巨核细胞分化的因素很多，KRAB-ZFPs是一类重要的转录调控因子，ZNF300是其典型成员，在PMA诱导K562细胞分化过程中表达上调，参与调控K562细胞巨核细胞分化。电离辐射可以促进PMA诱导的K562细胞巨核细胞分化，MAPK信号通路中ERK和P38MAPK参与此过程调控。过表达7号染色体开放阅读框41(C7ORF41)可以促进佛波酯诱导的K562细胞巨核细胞分化，p-ERK和JNK的蛋白水平升高。在PMA诱导K562细胞巨核细胞分化过程中，线粒体功能发生明显改变，ROS水平明显升高，线粒体膜电位下降，呼吸链复合体IV活性降低。而关于Daxx与K562细胞巨核细胞分化的关联研究目前尚未见报道。

为研究Daxx在K562细胞中的作用，建立稳定表达Daxx的K562细胞系，CCK8实验结果显示，Daxx过表达后，细胞活力显著降低。通过PMA诱导K562细胞向巨核细胞分化，发现在巨核细胞分化过程中p-ERK表达升高，Daxx表达下降，表明Daxx在K562细胞向巨核细胞分化过程中起抑制作用。PMA诱导Daxx-K562细胞后发现分化细胞数目降低，细胞巨核细胞分化指标CD41和CD61的表达显著降低，进一步表明Daxx参与抑制K562细胞向巨核细胞分化。Westernblot结果显示，Daxx过表达后，PMA诱导K562细胞向巨核细胞分化，p-ERK的蛋白水平降低，表明Daxx可能通过下调p-ERK来实现对K562细胞向巨核细胞分化的抑制，但有关深入的作用机制，还需要进一步的研究。