a型流感嗜血杆菌结合物游离多糖含量测定方法研究

　　流感嗜血杆菌包括可分型流感嗜血杆菌和不可分型流感嗜血杆菌，其中可分型流感嗜血杆菌根据荚膜多糖的结构又分为a～f6个血清型。接种b型流感嗜血杆菌(Haemophilusinfluenzaetypeb，Hib)结合疫苗的所有国家，侵袭性Hib疾病的发病率降低了90%以上，而Hia的发病率明显升高。Hia与Hib疾病类似，死亡率高，后遗症严重。目前北美本土人群Hia发病率全球最高，1988～2003年，美国西南地区5岁以内儿童年平均发病率为20.2/10万。2003～2011年，美国阿拉斯加共发生两次侵袭性Hia疾病暴发流行。借鉴Hib多糖蛋白质结合疫苗的成功经验，部分学者认为迫切需要制备Hia结合疫苗。
结合疫苗的游离多糖含量是质量控制的重要指标之一，有研究显示，结合物的游离多糖含量与其免疫原性密切相关，游离多糖含量超过10%时，会降低结合物的免疫原性，因此，需要对结合物的游离多糖含量进行准确定量。
载体蛋白质对结合疫苗结合化学的选择起重要作用，结合过程中可以选用载体蛋白质的羧基作为结合位点，也可选择氨基作为结合位点。对于TT，在甲醛脱毒的过程中会封闭一定量的氨基基团，反应不易控制，从而导致不同批次TT的氨基含量差异较大。某些情况下可衍生载体蛋白质，包括ADH衍生，从而获得活性更强的肼基基团;也可用琥珀酸酐进行衍生，在氨基上连接琥珀酸基团以降低结合反应过程中蛋白质聚合。不同类型载体蛋白质的表面电荷分布有较大差异，导致制备的结合物在电荷分布上也存在较大差异，因此，应摸索一种适用于不同电荷分布的结合物的游离多糖含量测定方法。本实验拟建立脱氧胆酸钠(NaDC)盐酸法结合蒽酮硫酸法，以适用于检测破伤风类毒素(tetanustoxoid，TT)、TTADH衍生物(ADHderivativeofTT，TTAH)、TT琥珀酰化衍生物(succinicanhydridederi-vativeofTT，TTSA)3种带有不同电荷的载体制备的Hia结合物的游离多糖含量。
1材料与方法
1.1样品Hia多糖降解物[荚膜多糖降解产物(depolymerizedpolysaccharide，de-PS)、批号：试De-201505003)]、Hia多糖衍生物[多糖降解物ADH衍生物(ADHderivativeofde-PS，de-PSAH)、批号：试HD-201506003)]、TT(批号：试HP-201209002)、TTAH(批号：试HD-201504003)、TTSA(批号：试HD-2015-08003)均由本公司第一研究室制备，其中Hia生产用菌株HK643由丹麦奥胡斯大学Dr.Kilian教授惠赠。本实验使用的TTAH和TTSA均由TT(试HP-201209002)衍生制备。衍生物及结合物均由本公司第一研究室制备，多糖衍生物：多糖降解物经CDAP活化后，与ADH一端的肼基连接制备;结合物(2015-06001和201508006)：EDAC缩合多糖衍生物的肼基与TT或TTSA的羧基共价结合制备;结合物(2015-06002和201506003)：CDAP活化多糖降解物后直接与TT或TTAH共价结合制备。
1.2主要试剂葡萄糖、蒽酮和NaDC均购自美国Sigma公司;盐酸、硫酸购自白银良友化学试剂有限公司。
1.3蛋白质含量测定参照《中国药典》三部(2010版) Lowry法测定蛋白质含量。
1.4多糖含量测定参照《中国药典》三部(2010版)蒽酮硫酸法测定多糖含量。
1.5游离多糖含量的检测采用NaDC盐酸法，具体参考文献]进行。将100μl1%NaDC(pH7.3)加入1ml待检样品中，振荡混匀，于2~8℃静置30min;加入50μl1mol/LHC1，振荡混匀，4℃，20000×g离心30min;取1ml上清，采用蒽酮硫酸法测定上清多糖含量。
1.6Hia结合物游离多糖含量测定方法的建立
1.6.1NaDC盐酸法对蒽酮硫酸法测定多糖含量的影响将葡萄糖标准品配制成0、10、20、30、40、50μg/ml浓度，按1.4项方法进行检测，绘制标准曲线1，计算相关系数(r2)。将葡萄糖标准品配制成0、11.5、23、34.5、46、57.5μg/ml浓度，按1.5项方法进行检测，此时，葡萄糖标准品的最终浓度与标准曲线1一致，绘制曲线2，计算r2。
1.6.2NaDC盐酸法沉淀TT、TTAH和TTSA最大能力的确定将TT溶液稀释至50、100、150、200、300、400、500、600和700μg/ml，TTAH溶液稀释至50、100、150、200、250、300、350、400和500μg/ml，TTSA溶液稀释至50、100、150、200、250、300、400、500、600和700μg/ml，按1.5项方法处理后，采用1.3项方法分别测定上清和总的蛋白质含量，按下式计算蛋白质沉淀效率。
1.6.3最佳离子浓度的确定制备多糖降解物与TT或TTAH的混合物A和B，多糖衍生物与TT或TTSA的混合物C和D，多糖与蛋白质的质量比均为1∶1，混合物、de-PS和de-PSAH溶液均在终浓度0、0.15、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.8、1.0和1.2mol/L的NaCl溶液中，多糖浓度均为60μg/ml。按1.5项方法，检测de-PS或de-PSAH以及混合物经NaDC盐酸法处理后上清的多糖含量，计算多糖回收率，确定最佳氯化钠离子强度。
1.6.4多糖与蛋白质最小质量比值的确定调整上述4种混合物中多糖与蛋白质的比值，并置于0.6mol/L的NaCl溶液中，多糖浓度为60μg/ml，混合物A、C和D多糖与蛋白质的比值为1∶2、1∶3、1∶4和1∶5，混合物B多糖与蛋白质的比值为1∶2、1∶3和1∶4。按1.5项方法，测定混合物上清的多糖含量，计算多糖回收率，确定多糖与蛋白质的最小比值。
1.7Hia结合物游离多糖含量测定方法的验证
1.7.1准确度参考文献方法，以添加回收试验即Spike试验验证游离多糖测定方法的准确度。在终浓度0.6mol/LNaCl的离子强度下，分别向结合物(201506001和201508006批)中添加不同浓度的de-PSAH，向结合物(201506002和201506003批)中添加不同浓度的de-PS，多糖加入浓度分别为6、12、35和56μg/ml，相应的葡萄糖含量分别为2.59、5.17、15.1和24.1μg/ml，按照1.5项方法，测定外加多糖的回收率。
1.7.2精密度在0.6mol/LNaCl的离子强度下，按照1.5项方法，测定结合物(201506001、201506-002、201506003和201508006批)的游离多糖含量，每天测定1次，共6次。
2结果
2.1NaDC盐酸法对蒽酮硫酸法测定多糖含量的影响当葡萄糖浓度在0～50μg/ml范围时，未经及经NaDC处理绘制的标准曲线的620nm吸光度值一致，均具有良好的线性，斜率分别为0.00500和0.00511，r2均大于0.999，表明NaDC盐酸法对蒽酮硫酸法测定多糖含量几乎无影响。
2.2NaDC盐酸法沉淀TT、TTAH和TTSA的最大能力当TT浓度在402.8μg/ml以下、TTAH浓度在352.5μg/ml以下时，蛋白质的沉淀效率均在95%以上;当TT浓度高于497.1μg/ml、TTAH浓度高于403.6μg/ml时，蛋白质的沉淀效率均低于95%;当TTSA浓度在691.0μg/ml以内时，蛋白质的沉淀效率均高于95%。因此，确定NaDC盐酸法沉淀TT、TTAH和TTSA的最大能力分别为402.8、352.5和691.0μg/ml。
2.3最佳离子浓度NaDC盐酸法处理de-PS或de-PSAH，多糖回收率均约100%，与盐离子浓度无关;但混合物的多糖回收率与盐离子浓度密切相关，在低浓度的盐离子强度下，多糖回收率偏低，只有将盐离子提高至一定浓度时，才能保证多糖回收率在95%以上。当混合物A和C的盐离子浓度不低于0.5mol/L、混合物B的盐离子浓度不低于0.6mol/L、混合物D的盐离子浓度不低于0.4mol/L时，多糖回收率才能在95%以上，因此，确定最佳盐离子浓度为0.6mol/L。
2.4多糖与蛋白质的最小质量比值混合物A和B质量比为1∶2时，多糖降解物的回收率均在95%以上;混合物C质量比为1∶2、1∶3和1∶4时，多糖衍生物的回收率均超过95%;混合物D质量比为1∶2、1∶3、1∶4和1∶5时，多糖衍生物的回收率均不低于95%。
2.5方法的验证
2.5.1准确度向4种结合物中添加12、35和56μg/ml的de-PS或de-PSAH时，外加多糖的回收率均在90%以上，但外加6μg/ml时，实际添加的葡萄糖含量为2.59μg/ml，是测定标准曲线的最低点的1/4，添加量相对较低，误差较大，但回收率也均在80%以上，，表明建立的方法针对不同结合物游离多糖含量的测定均具有良好的准确度。
2.5.2精密度游离多糖含量检测结果的CV均在10%以内，表明建立的方法对不同结合物游离多糖含量的测定均有良好的精密度。
3讨论
NaDC盐酸法测定游离多糖的理论依据是在低pH值的条件下，H+与NaDC形成质子化的简单NaDC胶团，质子化简单胶团通过酸盐结构的强氢键作用使NaDC初级胶团长大，形成较大的高级胶团，甚至形成凝胶状HnNam(Dc)n+m沉淀，从而达到测定游离多糖的目的。NaDC可以沉淀结合物及游离蛋白质，从而有效分离游离多糖，再利用蒽酮硫酸法测定上清中游离多糖含量。理论上蒽酮硫酸法测定多糖含量时，如果有残留的NaDC，也会参与反应而显色，影响检测结果。结果证明，本方法的NaDC不影响葡萄糖标准品的标准曲线，也说明本实验条件下的NaDC对Hia游离多糖含量的测定结果无影响，这与姚静等和沈坚等实验结果一致。实验中TTAH和TTSA两种衍生物均由同一批TT制备，从衍生位点的差异可知，羧基含量由高到低为TTSA>TT>TTAH，实验结果证明，1%NaDC对载体蛋白质的沉淀上限由高到低也为TTSA>TT>TTAH，因此，载体蛋白质的羧基含量越丰富，就越容易被NaDC沉淀。理论上在凝胶状沉淀中，羧基可以与NaDC形成强氢键，因此蛋白质的羧基数量越多时，可形成的强氢键越多，就越容易被NaDC沉淀，即在相同的实验条件下，1%NaDC沉淀的上限值越高。
NaDC盐酸法沉淀不同离子强度的多糖降解物
和多糖衍生物，上清多糖的回收率均约100%，与盐离子浓度无关，而当多糖降解物或多糖衍生物与载体蛋白质混合时，多糖的回收率随盐离子浓度的升高而增加，当盐离子达到一定浓度时，多糖降解物回收率接近100%。相同离子强度下，多糖降解物或多糖衍生物与TT等质量的混合物中，上清多糖回收率相似，表明多糖降解物和多糖衍生物电荷的差异对游离多糖含量的测定无明显影响。相同离子强度下，等质量的TT、TTAH或TTSA与多糖降解物或多糖衍生物的混合物中，回收率达到95%所需的离子浓度由高至低为TTAH>TT>TTSA，多糖的回收率与蛋白质的衍生方式有关。Hia多糖降解物和多糖衍生物的重复单位上均含有负电荷的磷酸基团。样品经NaDC和盐酸处理后，pH值约3.0。该条件下，3种蛋白质的正电荷数量由高到低为TTAH、TT、TTSA。说明蛋白质的氨基含量越多，所带的正电荷越多，其与多糖降解物或多糖衍生物的结合能力就越强，上清多糖的回收率就越低，达到彻底分离所需的离子强度就越高。在多糖与蛋白质质量比值更低的混合物中，这一推测也得到了验证。
本实验依靠增加离子强度消除多糖降解物及多糖衍生物与载体蛋白质间的相互作用，并对实验进行了系统验证。建立的操作方法快速、简便，重复性强，准确度和精密度均符合要求，适用于不同类型的载体蛋白质制备的Hia结合物游离多糖含量的测定。