小鼠白细胞介素33真核表达质粒的构建

白细胞介素-33(IL-33)是2005年发现的细胞因子，为IL-1类细胞因子超家族成员，广泛存在于多种组织细胞中，是炎症反应的重要调节因子之一。目前认为IL-33具有双重生物学功能，即在正常状态下存在于细胞核中，作为转录抑制因子发挥作用;细胞损伤时释放到胞外成为一种免疫系统的危险信号，与受体ST2结合，作为细胞因子发挥免疫调节作用。小鼠的IL-33cD-NA编码266个氨基酸，其相应全长蛋白质的相对分子质量为30kD。有研究表明全长IL-33是参与机体活动的有效形式，剪切后的可溶性IL-33活性下降，主要在血清中出现，可能成为一种疾病标记物。但是另有研究发现，全长IL-33经过中性粒细胞弹性蛋白酶和蛋白酶G剪切能够产生生物活性10倍于全长IL-33的片段。综上所述，IL-33的活性形式依然存在争议。为了进一步研究IL-33活性，本文利用基因工程的方法在大肠埃希菌中高效表达出鼠IL-33成熟蛋白，并对免疫学活性进行了初步研究，为深入研究IL-33的免疫学作用及其分子机制提供参考。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1实验动物、菌株与质粒C57BL/6小鼠购自中国医科大学实验动物中心;大肠埃希菌E.coli-DH5、COS-7细胞、表达载体pcDNATM3.1/myc-HisA由本室保存。

1.1.2试剂RNAisoPlus、载体连接试剂盒、限制性核酸内切酶、PCR试剂、T4DNA连接酶购自TaKaRa公司，DNA凝胶回收试剂盒、质粒抽提试剂盒购自北京原平皓公司，Trizol、EasyScriptcDNA第一链合成试剂盒为全式金公司产品，lipofectamine2000转染试剂购自Invitrogen公司，DMEM培养基、新生小牛血清、细胞裂解液、蛋白酶抑制剂购自汇百生物公司。抗Myc的单克隆抗体购自北京康为世纪生物科技有限公司。其他试剂为进口或国产分析纯。

1.2方法

1.2.1引物设计与合成根据GenBank小鼠IL-33序列和pcDNA3.1/myc-HisA载体特性，按照酶切位点对侧翼序列的要求设计引物并包含相应的酶切位点(引物合成由南京金斯瑞生物科技有限公司完成)。IL-33上游引物:AGCAAGCTTGCCACCATGAGACCTAGAATGAAGTAT，含酶切位点HindⅢ;下游引物:AGCTCTAGAGATTTTCGAGAGCTTAAAC，含酶切位点XbaⅠ，不含终止密码子。上游引物中含有Kozak序列。同时，调整下游引物使IL-33能融合表达Myc和HisA标签。

1.2.2RNA的提取及RT-PCR用RNAisoPlus提取C57BL/6小鼠肺组织总RNA，按全式金公司提供的cDNA第一链合成说明进行反应获得cDNA，随即进行聚合酶链反应(PCR)获得IL-33基因编码序列，反应条件:95℃5min，进入循环，94℃30s，54℃30s，72℃1min，共30个循环，最后72℃延伸10min。产物经1%溴化乙锭-琼脂糖凝胶电泳分离分析PCR产物，用DNA回收纯化试剂盒回收扩增的目的基因。

1.2.3IL-33cDNA的克隆及测序将上述回收片段经HindⅢ与XbaⅠ双酶切，插入上述酶酶切线性化的pcDNATM3.1/myc-HisA载体，连接后转化DH5α感受态菌，过夜培养后挑取白色单菌落，小量提取质粒DNA进行酶切鉴定，命名为pcDNA3.1-IL-33。送南京金斯瑞生物公司进行插入片段序列测定。

1.2.4重组质粒的细胞转染与表达对数生长期COS-7细胞培养于含血清及双抗的DMEM培养液中，于37℃、5%CO2培养箱中培养，将3×105个细胞/孔接种于6孔板，每孔DMED培养基定容至3mL，培养24h后，采用lipofectamine2000转染试剂按试剂说明转染pcDNA3.1-IL-33与空载体，并设空白对照，10h后弃去转染液，换新鲜培养基继续培养，转染后24h分别收集实验孔及空载体对照孔、空白对照孔的细胞，提取细胞总RNA，RT-PCR检测细胞IL-33基因表达;于转染后不同时间用冰冷细胞裂解液裂解细胞，收集细胞裂解产物，Westernblot法检测培养细胞IL-33表达，检测方法按试剂说明进行。

2结果与分析

2.1RT-PCR扩增小鼠IL-33基因分离小鼠肺组织总RNA，进行1%琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下可见3条清晰条带，分别为28SRNA、18SRNA和5SRNA，28SRNA与18SRNA无弥散现象，说明RNA未被降解。总RNA经逆转录为cDNA后进行PCR反应，将产物进行1%琼脂糖凝胶电泳可见一亮带，大小约801bp，与IL-33基因片断预期大小相符。

2.2pcDNA3.1-IL-33真核表达质粒的构建HindⅢ与XbaⅠ双酶切后的小鼠肺组织IL-33的PCR产物经过琼脂糖凝胶电泳回收，与上述酶酶切后的pcDNA3.1/myc-HisA进行定向连接，连接后转化DH5α感受态菌。抽提质粒，行HindⅢ与XbaⅠ双酶切鉴定，经10g/L琼脂糖凝胶电泳结果与预期相符。南京金斯瑞生物科技有限公司DNA测序结果与IL-33cDNA序列一致。

2.3重组质粒在COS-7细胞中的表达分别收集空白对照、pcDNA3.1-IL-33与空载体转染的COS-7细胞，逆转录获得cDNA模板进行PCR扩增。结果表明，从重组质粒转染的COS-7细胞中可扩增出IL-33基因，而空质粒转染和未转染细胞中未扩增出目的条带，Westernblot法证实pcDNA3.1-IL-33转染细胞48h后的细胞裂解产物可检测到IL-33，而空载体转染细胞和未转染细胞未检测到其表达。

3讨论

IL-33作为新近发现的一种细胞因子和核因子，在炎症性肠病中扮演重要角色。有研究认为IL-33具有“警报素”作用，当各种原因导致肠上皮细胞破坏时，IL-33作为一种危险信号从细胞中释放，激活肥大细胞和嗜碱、嗜酸性粒细胞等，促进多种炎症细胞因子的产生，并促进初始性T细胞向Th2细胞分化，趋化Th2细胞到达病灶，发挥促炎作用。同时，还有研究发现IL-33能使炎症性肠病动物模型炎症程度减轻，症状改善，说明IL-33能抑制炎症进展。总之，目前研究表明IL-33在炎症性肠病发病中可能具有双重作用，其参与炎症性肠病炎症进展的具体作用机制仍未完全清楚，且需进一步发掘并探索IL-33是否具有治疗价值。

本研究选择真核表达载体pcDNATM3.1/myc-HisA，成功构建了pcDNA3.1-IL-33真核表达质粒，通过体外转染细胞，转染后的细胞能够成功表达带Myc、His标签的小鼠IL-33全长蛋白。下一步可以通过6×His标签对IL-33融合蛋白进行纯化，通过pull-down实验研究筛选IL-33相互作用蛋白。此外，Myc标签还可以用于免疫共沉淀和免疫印迹实验，为研究IL-33蛋白在体内的作用及信号通路提供了有力的工具。虽然本研究已经成功构建全长IL-33的真核表达质粒，但由于不同大小IL-33的活性及作用一直存在争议，需要进一步克隆不同大小的IL-33序列并构建其真核表达质粒，为进一步研究IL-33的功能和活性提供工具。

综上所述，本研究成功构建了带His、Myc双标签的pcDNA3.1-IL-33真核表达质粒，将其转染到COS-7细胞并在体外成功表达了带HisA和Myc双标签的小鼠IL-33全长蛋白，为下一步研究IL-33在炎症性肠病的作用及其分子机制奠定了基础。