携Apoptin和PEG3启动子双特异性重组腺病毒的构建

腺病毒(adenovirus，Adv)是一种无囊膜的双链DNA 病毒，基因组大小约为36kb。迄今为止，已发现的人腺病毒有100多种血清型，其中用于人类肿瘤基因治疗的多为人5型腺病毒。基因治疗因可逆转肿瘤细胞表型或诱导细胞自我毁灭而备受关注，病毒疗法为其中的主要领域。

RAPAd.Ⅰ腺病毒载体系统可用于构建重组腺病毒，该载体缺失腺病毒基因组骨架的左臂反向末端重复区(ITR)、包装信号及早期区1基因(E1)，最大程度地降低包装过程中野生型腺病毒的污染。病毒所携带的目的基因-凋亡素是一种小分子蛋白，来源于鸡贫血病病毒，能够通过诱导凋亡特异性杀伤肿瘤细胞，而对正常细胞几乎没有杀伤作用。PEG3是一种有效的肿瘤标志物，在肿瘤的发展和DNA 损伤中高度表达，具有致瘤性和促进血管发生的作用，在肿瘤细胞中的表达量远高于正常细胞，进行性增量基因3(PFG3)启动子(progression-elevated　genes　3promoter，PEG3p)具有良好的肿瘤特异性。本研究拟利用RAPAd.Ⅰ腺病毒载体系统，结合Apoptin和PEG3p，构建具有肿瘤特异性杀伤和复制功能的双特异性溶瘤腺病毒Ad-Apoptin-PEG3p-E1a，为进一步探讨其肿瘤生物治疗用途奠定基础。

材料与方法

1　材料

大肠埃希菌E.coli　DH5α感受态，人胚胎肾细胞(HEK293)，人非小细胞肺癌细胞(A549)，人正常肝细胞(L02)，质粒pMT-E1a、pIRES-neo、pKS-PEG3p、pAd-Apoptin、pAd5均由本实验室保存;RNA 提取试剂盒购自宝生物(大连)公司;脂质体X-tremeGENEHP购自瑞士ROCHe公司，3-(4，5-二甲噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐(MTS)购自美国Promega公司。

2　方法

2.1　细胞培养

HEK293细胞在DMEM(10%胎牛血清，100U/L青霉素，100U/L链霉素)中于37℃、5%CO2条件下培养至对数生长期，用2.5g/L胰蛋白酶消化后制备单细胞悬液，调整细胞浓度至1.5×105个/ml，接种于六孔板(每孔2ml)，培养12h～24h后用于转染。

2.2　穿梭质粒构建

用PstⅠ和BumHⅠ双酶切质粒pMT-E1a，获得目的片段E1a，与经同样双酶切的pKS-PEG3p 连接，构建质粒pSK-PEG3p-E1a。用XbaⅠ和XhoⅠ双酶切质粒pIRES-neo，获得PolyA核苷酸片段，补平后与经HindⅢ酶切并补平的pSKPEG3p-E1a连接，构建质粒pSK-PolyA-PEG3p-E1a。用BumHⅠ酶切pAd-Apoptin，补平后再用SpeⅠ酶切，回收线性化的pAd-Apoptin。用XhoⅠ酶切pSKPolyA-PEG3p-E1a，补平后再用SpeⅠ酶切，获得目的基因-PolyA-PEG3p-E1a，将其与线性化的pAd-Apoptin连接，构建质粒pacAd-PEG3p-E1a-Apoptin。

2.3　重组腺病毒Ad-Apoptin-PEG3p-E1a的包装

用PacⅠ单酶切pacAd-PEG3p-E1a-Apoptin和腺病毒骨架质粒(pAd5)进行线性化处理，酶切产物用无水乙醇沉淀回收，并将线性化质粒共转染HEK293细胞，培养7～10d待病毒复制到一定程度时收集并反复冻融3次，然后重新接种HEK293细胞进行扩增，获得的病毒进行RT-PCR、Western　blot和电镜鉴定。

2.4　RT-PCR 检测

培养接种重组腺病毒的HEK293细胞至80%～90%病变时提取病毒总RNA进行反转录，然后以3μl　cDNA为模板，以Apoptin、E1a特异引物进行RT-PCR。PCR扩增的反应体系：12.5μl　2×Mix　buffer，上、下游引物各0.3μl，补加双蒸水至25μl。反应条件：95℃3min;94℃30s，57℃30s，72℃30s，共30个循环;72℃延伸10min。

2.5　Western　blot检测

培养接种重组腺病毒的HEK293、A549细胞至80%～90%病变时收获细胞，按文献[8]的方法进行Western　blot实验，五磷体检测以山羊源多克隆抗体(5%脱脂乳1000倍稀释)为一抗，二抗为鼠抗羊IgG-HRP(PBS800倍稀释);E1a检测以兔源多克隆抗体(5%脱脂乳1　000倍稀释)为一抗，二抗为羊抗兔IgG-HRP(PBS800倍稀释)。

2.6　电子显微镜观察重组腺病毒形态

将重组腺病毒Ad-Apoptin-PEG3p-E1a接种于HEK293细胞，48h后刮去细胞，超声破碎，以3　000r/min(离心半径6.9cm)离心10min，取上清液进行负染，电镜下观察病毒形态。

2.7　MTS法检测抑瘤率

于96孔板制备A549单层细胞(5×103 个/孔)，利用不同程度感染复数(1、10、100MOI)的Ad-Apoptin-PEG3p-E1a、Ad-PEG3p-E1a、Ad-Apoptin、Ad-mock分别感染24、48、72和96h，每组设4个复孔。L02细胞经同样处理作为对照。于培养结束前，每孔加入20μl　MTS液37℃继续培养1h，用酶标仪(TECAN公司生产)在492nm下测定吸光度(A)值，计算细胞增殖抑制率。细胞增殖抑制率(%)=[(对照孔A值-实验孔A值)/对照孔A值]×100%。

2.8　绘制重组腺病毒一步生长曲线

用六孔板培养HEK293细胞(每孔1×106 个)，12h～24h后接种100MOI　Ad-Apoptin-PEG3p-E1a，分别于感染后第12、24、48、96h收获细胞，超声破碎后在HEK293细胞上测定病毒滴度，计算每毫升病毒液中所含空斑形成单位(PFU)。PFU/ml=(病毒空斑数× 稀释倍数)/接种体积。

结　果

1　质粒pacAd-Apoptin-PEG3p-E1a的构建

用EcoRⅠ和BumHⅠ双酶切质粒pacAd-Apoptin-PEG3p-E1a，酶切片段大小分别为6　637bp 和1　833bp，与预期相符，质粒pacAd-Apoptin-PEG3p-E1a构建成功。

2　重组腺病毒的包装

线性化的质粒pacAd-Apoptin-PEG3p-E1a 和pAd5共转染HEK293细胞，培养约10d可见到明显噬斑，表明包装出病毒。

3　重组腺病毒的Western　blot鉴定

重组腺病毒转染HEK293 细胞后进行培养，Western　blot检测在分子质量单位为108ku处出现特异性条带，与五磷体阳性对照一致，该重组病毒表达五磷体(为腺病毒蛋白)，即该病毒为腺病毒。

4　重组腺病毒形态

电镜下观察重组病毒无囊膜，衣壳呈二十面体立体对称，每面呈正三角形，为腺病毒典型形态。

5　重组病毒携带目的基因的Western　blot鉴定

重组腺病毒转染A549细胞后连续培养，Westernblot检测出现分子质量单位为50ku的反应条带，与E1a阳性对照一致，表明包装出的腺病毒携带目的基因E1a并表达E1a蛋白。

6　重组腺病毒的RT-PCR鉴定

对重组腺病毒感染的HEK293细胞的RNA进行RT-PCR，扩增出于Apoptin同等大小的目的基因，表明目的基因Apoptin整合入腺病毒基因组。

7　重组腺病毒的抑瘤率检测

MTS检测显示，重组腺病毒Ad-Apoptin-PEG3p-E1a有明显的抑瘤作用，且抑瘤效果显著强于Ad-PEG3p-E1a、Ad-Apoptin、Ad-mock。在感染时间相同的条件下，随感染剂量的增加，Ad-Apoptin-PEG3p-E1a对A549细胞的抑制率明显增加，具有量效关系(用SPSS17.0软件进行方差分析，P<0.05);在感染剂量一定的条件下(100MOI)，随感染时间的延长Ad-Apoptin-PEG3p-E1a对A549细胞的抑制率明显增加，具有时间效应关系(用SPSS17.0软件进行方差分析，P <0.05)。Ad-Apoptin-PEG3p-E1a 对A549细胞的抑制作用在100MOI、96h达峰值，为(79.84±1.0)%，Ad-PEG3p-E1a、Ad-Apoptin、Admock分别为(69.19±2.70)%，(17.47±5.05)%，(13.74±6.02)%，差异均有统计学意义(用SPSS17.0软件进行方差分析，P<0.05)。Ad-Apoptin-PEG3p-E1a对正常L02细胞的增殖无明显影响。

8　Ad-Apoptin-PEG3p-E1a一步生长曲线

重组腺病毒Ad-Apoptin-PEG3p-E1a感染A549、L02细胞后，分别在不同时间收集病毒液，测定病毒滴度，表明该重组腺病毒具有正常复制能力。

讨　论

随着人们对肿瘤发生发展机制认识的不断深入，基因疗法成为攻克恶性肿瘤最有希望的治疗手段，其中基于溶瘤腺病毒的肿瘤基因治疗更是研究焦点。本研究采用RAPAd.Ⅰ系统对重组腺病毒进行构建，该系统为避免野生型腺病毒的污染将病毒复制与包装相关信号序列从腺病毒基因组骨架质粒中剔除，并将其转移至穿梭质粒中，这样只有当腺病毒骨架质粒与穿梭质粒重组后才能使病毒包装和复制。

Apoptin因能诱导人肿瘤细胞凋亡而被命名为凋亡素。Apoptin引起的细胞凋亡不依赖抑瘤基因p53的介导，不受抗凋亡因子Bcl-2的抑制，也不依赖死亡因子，但Apoptin引起的细胞死亡很大程度上受线粒体途径的监督。Apoptin在正常细胞中位于细胞质，而在肿瘤细胞中位于细胞核，这种细胞核定位与Apoptin的肿瘤特异性凋亡作用密切相关。实验证明，Apoptin具有广谱的肿瘤凋亡效应，而对正常细胞无毒性。Apoptin针对肿瘤具有特异性凋亡作用，其机制较明确，有望解决肿瘤基因治疗过程中高效性和特异性难于统一或易于产生耐药性的问题。

PEG3p是PEG 启动子的最小功能单位，肿瘤细胞中存在大量的PEG3p转录因子结合位点PEA-3、AP-1，而这两种转录因子在正常细胞中未能检测到，因而增强了PEG3p的肿瘤选择性。陈智飞等的研究显示PEG3对结直肠癌有靶向作用。Madireddi等研究发现PEG3对乳腺癌有靶向作用。Fisher等报道PEG3p其对恶性胶质瘤细胞，恶性黑色素瘤细胞和卵巢癌细胞也有同样的靶向表达作用。PEG3p的这种在肿瘤细胞中选择性驱动靶基因表达的特性将被广泛应用于人类肿瘤的基因治疗。

本研究构建了肿瘤特异性杀伤和复制型腺病毒，病毒基因组中巨细胞病毒(cytomegalovirus，CMV)启动子在上游驱动特异性抑瘤基因Apoptin，使病毒具有特异性溶瘤作用，PEG3p在下游驱动腺病毒5型早期区1A基因(eraly　region　1A，E1a)，使病毒能够特异性复制，这样重组腺病毒Ad-Apoptin-PEG3p-E1a具有了特异性杀伤和特异性复制的双特异性溶瘤作用，经MTS检测有对肿瘤细胞的特异性杀伤和特异性复制作用。

恶性肿瘤的治疗以手术、化疗和放疗为主，但传统疗法副作用大且对肿瘤的特异性低，随着分子生物学、分子遗传学及免疫学的渗透和发展，基因疗法有望成为具有特异性和有效性的肿瘤治疗新途径。MTS检测表明，本研究构建的重组腺病毒对肿瘤细胞具有特异性杀伤作用，具有临床开发潜质。