携带肝细胞生长因子基因的减毒沙门菌促血管形成的实验分析

血管发生或新生在胚胎器官的发育、出生后创面伤口愈合及多种病理情况下都起着非常关键的作用。近年来研究表明，生长因子在细胞的增殖、迁移、损伤修复、溃疡愈合及免疫调节等方面起重要作用，已有研究表明，肝细胞生长因子(hepatocytegrowthfactor，HGF)是一种多功能生物因子，具有促进血管内皮细胞增殖和新血管形成作用，还可促进组织细胞的再生、抑制细胞凋亡，可以调节炎症、促进创伤愈合。胃溃疡是一种常见消化道疾病，其病程常反复且迁延不愈，而上皮化和血管形成是胃溃疡愈合必不可少的过程，因此，本研究依据胃溃疡愈合过程原理，构建了携带HGF基因真核表达载体的减毒的沙门菌菌株(TPH)，该菌株具有以下优势和特点：①采用的是基因治疗方法，使局部转染质粒的真核细胞作为一“微型药物工厂”持续一定时间分泌表达HGF活性蛋白;②利用HGF的多功能修复作用，促血管形成;③减毒沙门菌是一良好的口服基因传递载体，对胃肠黏膜组织有亲嗜作用，有望发展成一种口服基因治疗药物;④HGF已证明可抑制瘢痕，可减少愈合后的溃疡瘢痕，可能阻止并发症的发生。从而认为该菌株可能具有促进胃溃疡愈合的作用。

本文旨在探讨构建的TPH的促血管形成效应，为其促进胃溃疡创面愈合机制提供实验依据。

1材料与方法

1.1材料

人胎盘cDNA文库、pSK购自美国Clontech公司;pEGFP-N1及pcDNA3为本室保存;琼脂糖、Taq酶、dNTP、限制性内切酶、T4DNA连接酶、核酸凝胶回收试剂盒均购自生工生物工程(上海)股份有限公司;酵母提取物及蛋白胨购自美国Merck公司;Ty21a菌株为军事医学科学院惠赠;人脐静脉内皮细胞(HUVEC)购自美国模式菌种收集中心(ATCC);DMEM和胎牛血清购自美国Gibco公司;抗人HGF单克隆抗体、重组人HGF蛋白纯品购自美国R&D公司;辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG购自美国SantaCruzBiotechnology公司;孵育第13天的鸡胚购自中国农业科学院畜牧研究所;M450甲基纤维素购自美国Sigma公司;Multiporator4308型电转仪购自德国Eppendorf公司。

1.2方法

1.2.1携带HGF基因减毒沙门菌菌株的构建

1.2.1.1携带人HGF基因的真核表达载体

pcK-HGF的构建按人HGFcDNA序列设计引物，正向引物序列为5'ccatcgatgttaacatgtgggtgaccaaactc3'，反向引物序列为5'tgggatccgcggccgcctatgactgtggtacctt3'。从人胎盘cDNA文库克隆人HGFcDNA(约2.2kb)。并将HGF基因的PCR产物克隆至pSK载体的BamHI和SalI酶切位点中，命名为pSK-HGF。将pcDNA3载体用SspI及AvrII双酶切，回收大片段(约4.9kb)，pEGFP-N1用AvrII酶切，回收小片段(卡那霉素基因，1.1kb)，用T4DNA连接酶将回收的大小片段连接，获得卡那霉素抗性的pcDNA3载体，以避免患者青霉素过敏，命名为pcK。分别用BamHI和ApaI双酶切pcK及pSK-HGF，回收大片段及小片段，用T4DNA连接酶连接，获得携带人HGF基因的含卡那霉素抗性基因的真核表达载体，命名为pcK-HGF。

1.2.1.2真核表达质粒pcK-HGF电穿孔转化减毒沙门菌将减毒沙门菌Ty21a接种于LB培养液，振荡培养至对数生长中期，低温4000r/min离心收集菌体，用预冷的无菌去离子水洗涤细胞2次后重悬。用电转仪将pcK-HGF和pcK质粒各0.2μg转入200μl预处理的Ty21a。37℃轻柔振荡培养45min后涂布于含卡那霉素(100mg/L)固体LB培养基平皿继续培养，次日挑取菌落进行鉴定。

1.2.1.3阳性工程菌的筛选从培养板挑取单菌落分别接种于含卡那霉素LB培养液中，37℃振摇培养。转入pcK-HGF的减毒沙门菌阳性菌株的筛选通过卡那霉素抗性、PCR(利用菌液为模板，扩增真核表达启动子CMV及目的基因HGF)及提取质粒后BamHI/ApaI双酶切鉴定;转入pcK的减毒沙门菌菌株的筛选通过卡那霉素抗性及PCR筛选(利用菌液为模板，扩增真核表达启动子CMV)。CMV扩增引物：5'cccagtacatgaccttatggg3'，5'ggagacttggaaatccccgt3'。HGF扩增引物：5'ccatcgatgttaacatgtgggtgaccaaactc3'，5'tgggatccgcggccgcctatgactgtggtacctt3'。

1.2.2重组减毒沙门菌活性观察

1.2.2.1重组减毒沙门菌转染HUVEC将HUVEC接种于6孔细胞培养板中，每孔6×105个细胞，次日用无抗生素DMEM培养液洗涤细胞2次，分别将1×108cfu携带pcK和携带pcK-HGF质粒的减毒沙门菌加入HUVEC细胞中，37℃共孵育30min，用含庆大霉素(50mg/L)的无血清培养基洗涤细胞后加入含10%胎牛血清的DMEM培养基，37℃孵育4h后加入四环素至终浓度为10mg/L，继续培养48h收集细胞上清，用双抗夹心ELISA法检测上清中HGF的表达水平。一抗为抗人HGF单克隆抗体(1mg/ml)，二抗为辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG，用新鲜配制的OPD底物显色液显色，同时用重组人HGF标准蛋白作标准曲线，以计算上清中HGF的表达量。

1.2.2.2HGF表达上清对HUVEC的作用分析采用MTT法测定细胞增殖活性。将HUVEC接种于96孔细胞培养板中，每孔细胞数5×103个。12h后吸弃原培养液，每孔加入100ml无血清DMEM，HGF表达上清所加的量分别含HGF100、200、400、800、1600pg。72h后每孔加入20mlMTT，37℃孵育4h后，弃上清，用DMSO溶解沉淀，测其在560nm波长处吸光度(A)。

1.2.2.3HGF表达上清对鸡胚绒膜尿囊膜血管刺激作用观察采用我们前期报道的实验方法制备甲基纤维素碟。实验分三组：转染携带pcK-HGF质粒的减毒沙门菌的HUVEC细胞上清组(HGF表达产物800pg)、转染携带pcK质粒的减毒沙门菌的HUVEC细胞上清组(同体积上清)及对照组(同体积转染PBS的HUVEC细胞上清)，分别将三组上清加入甲基纤维素碟内，每组6胚，按操作程序进行下一步实验操作。之后按文献方法计数每组以甲基纤维素碟为中心周围1cm2辐射出新生小血管的数量。

1.3统计学处理

实验数据以x±s表示，所有数据采用SPSS10.0版软件的单因素方差分析，t检验进行均数两两比较，P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1携带HGF基因减毒沙门菌菌株TPH的构建

2.1.1HGF表达质粒的鉴定对PCR所得HGFcDNA测序结果表明，其序列与GenBank已公布的人HGFcDNA序列(M60718.1)完全一致。克隆至真核表达载体pcK后采用限制性内切酶及抗生素抗性鉴定。用BamHI和ApaI双酶切后可在琼脂糖凝胶电泳图上见一约2.2kb的DNA片段，质粒转化后可在含卡那霉素的琼脂培养板上生长转化子克隆。表明我们成功构建了HGF的表达质粒pcK-HGF。

2.1.2阳性工程菌的筛选工程菌可在含卡那霉素的LB琼脂平板上生长，从单克隆中PCR可扩增出真核表达启动子CMV和目的基因HGF，提取质粒用BamHI/ApaI双酶切后，在电泳图上可见一约2.2kb的DNA片段，表明pcKH已成功转入减毒沙门菌菌株，命名为TPH。

2.2TPH转染HUVEC后HGF的表达及对HUVEC细胞的增殖刺激活性1×108cfuTPH转染HUVEC细胞48h后，用双抗夹心ELISA方法检测上清中HGF的表达。结果表明，6×105个HUVEC细胞可表达160~190ng的HGF蛋白。采用MTT法分析了含不同剂量HGF表达上清对HUVEC细胞的作用，结果表明，含HGF表达上清有明显刺激HUVEC增殖的活性(P<0.05)，而且具有剂量-效应关系。加入800pg表达上清时刺激活性达高峰，剂量加大活性不再明显增加。

2.3细胞表达上清对鸡胚绒膜尿囊膜血管刺激作用置入含细胞表达上清的甲基纤维素碟后，鸡胚绒膜尿囊膜(chickenchorioallantoicmembrane，CAM)继续孵育3d，之后将鸡胚绒膜尿囊膜固定后取出，以小碟为中心计数小血管数。结果对照组在小碟周围观察到较弱的生血管效应，转染TP的HUVEC细胞上清组观察到较明显的小血管增多现象，转染TPH的HUVEC细胞上清组(HGF表达产物800pg)以小碟为中心观察到明显的毛刷样小血管形成，转染TPH的HUVEC细胞上清组血管数量为(133.0±11.5)/cm2，明显大于转染TP的HUVEC细胞上清组(83.3±5.5)/cm2和对照组(62.7±7.1)/cm2(P<0.05)。

3讨论

HGF最初是从血浆和血小板中纯化获得并认为是一种刺激肝细胞增生的有丝分裂原，对肝切除或化学损伤后的肝再生起重要作用。目前，已知HGF主要来源于内皮细胞、成纤维细胞、脂肪细胞等间质细胞，由前体蛋白(Pro-HGF)经剪切、糖基化等翻译加工合成，由69kD的α亚基和34kD的β亚基组成的异二聚体。HGF受体为C-met癌基因编码的蛋白质，结构上属于11型酪氨酸激酶受体，具有细胞外结合、跨膜和细胞内激酶区域。

HGF的作用是通过与其受体结合而实现的。HGF作用于多种类型的细胞，具有多样的生物学作用。它可刺激细胞增殖，修复组织器官的损伤，发挥有丝分裂原的作用，可促进胚胎的发育及各类组织器官的形态发生，发挥形态发生原的作用，它还可促进细胞的迁移和侵袭，对某些组织的形成和发育及肿瘤的转移、侵袭具有重要意义。已有许多研究表明HGF能促进内皮细胞增殖迁移，促进损伤局部血管形成。血管发生的研究起初是用于肿瘤血管发生机制的探讨，之后研究领域渐渐扩大，如血管的发育来源、血管发生的分子特性及基因调控、肿瘤的诊断治疗、缺血性疾病的治疗和创面愈合等，也用于筛选治疗缺血性疾病、促进伤口愈合和抗肿瘤的药物。显微水平血管研究实验模型多用鼠或兔角膜和CAM，本研究我们选择了CAM作为体内TPH促血管形成治疗溃疡愈合潜能的模型，CAM是鸡胚发育第4天由体中胚层和脏壁中胚层融合而成的富含血管的膜，由内向外由内皮细胞层、大血管层、毛细血管筛层3层组成，负责血气交换。因CAM容易获得且此模型操作简单、快速、经济、有效，多用于血管形成效应研究。

本实验结果表明对照组在小碟周围观察到较弱的生血管效应，转染TP的HUVEC细胞上清组观察到较明显的小血管增多现象，转染TPH的HUVEC细胞上清组以小碟为中心观察到明显的毛刷样小血管形成，通过定量计数转染TPH的HUVEC细胞上清组血管数量明显大于转染TP的HUVEC细胞上清组和对照组(P<0.05)。在组织损伤再修复中，上皮和间质间存在极为重要的信息交换，HGF是机体间质和上皮信息交换分子。在胃溃疡愈合过程中，HGF和c-met受体表达增加，醋酸型溃疡主要是由于醋酸直接损伤胃壁组织，引起局部血循环障碍而造成的，Brozowski等研究认为用HGF治疗胃溃疡能通过影响COX-2的表达和胃黏膜血流而加速溃疡愈合。大鼠胃黏膜HGFmRNA分布于再生腺体与黏膜下组织动脉血管之间的基质细胞中，其受体c-metmRNA则位于再生腺体上皮细胞，HGF能使正常大鼠胃黏膜上皮细胞环氧化酶-2mRNA和蛋白表达分别增加至236%和175%。环氧化酶-2系前列腺素合酶，能促进前列腺素的合成，而前列腺素对胃黏膜细胞具有保护作用，能增加黏膜的血液循环，HGF也可能通过增加前列腺素合成促进胃溃疡的愈合。

由此可见，我们构建的携带HGF基因的减毒沙门菌TPH有潜在治疗胃溃疡的作用，其体内防治胃溃疡的效果有待进一步研究。本研究所选用的减毒沙门菌株Ty21a是由Germanier于1975年将其野型株Ty2经化学突变剂亚硝基胍处理而获得的突变株，是目前用于人群预防的减毒疫苗株。研究中我们利用减毒沙门菌作为基因传递载体的优势，用Ty21a作为载体将HGF基因携带至损伤创面局部，使局部转染质粒的细胞作为一“微型药物工厂”持续一定时间分泌表达HGF活性蛋白而发挥其多功能生物作用。由于HGF蛋白半衰期极短，容易降解，给药不方便，而且成本高;培养携带HGF基因的减毒鼠伤寒沙门菌成本低，繁殖快;而编码外源基因的真核质粒递呈入抗原提呈细胞，外源基因在其中表达并持续释放，从而达到基因治疗疾病的目的。

综上所述，本实验通过构建携带肝细胞生长因子基因真核表达载体的减毒沙门菌菌株TPH，体外观察TPH在HUVEC中的表达情况，然后探讨目的基因表达上清对HUVEC的增殖活性，并评价表达上清对鸡胚绒膜尿囊膜血管生成效应的刺激效应，目的是评价携带HGF基因的减毒沙门菌株TPH是否在组织创面愈合中通过促进血管形成而起促愈合作用。本实验结果提示，TPH可能在溃疡治疗中有潜在的应用价值。