干扰素诱导的跨膜蛋白家族及其抗病毒机制研究

固有免疫系统构成机体抵御病毒感染的第一道防线，通过宿主特异性模式识别受体(patternrecognitionreceptor，PRR)识别病原，进而产生细胞因子、趋化因子、干扰素(interferon，IFN)等多种抗病毒因子。1型IFN是主要的抗病毒细胞因子，结合于其相应的受体后，通过Janus激酶-信号转导子和转录激活子(Januskinase-signaltransducerandactivatoroftranscription，JAK-STAT)信号通路，激活数量众多的干扰素诱导基因(interferon-stimulatedgenes，ISG)。干扰素诱导的跨膜蛋白(interferon-inducibletransmembraneprotein，IFITM)是新近发现的具有抗病毒作用ISG编码产物，并且证明其在多种生物过程发挥作用，包括:免疫细胞信号转导、细胞归巢与成熟以及骨矿化。IFITM家族同时具有广泛的抗病毒作用，对多种病毒发挥抑制作用，包括:甲型流感病毒(influenzaAvirus，IAV)、西尼罗病毒(WestNilevirus)、登革病毒(denguevirus，DENV)、线状病毒(filovirus)、人类免疫缺陷病毒1型(humanimmunodeficiencyvirus-1，HIV-1)、丙型肝炎病毒(hepatitisCvirus，HCV)、委内瑞拉马脑炎病毒(Venezuelanequineencephalitisvirus，VEEV)、基孔肯雅病毒(Chikungunyavirus，CHIKV)、水泡性口炎病毒(vesicularstomatitisvirus，VSV)和严重急性呼吸综合症(severeacuterespiratorysyndromes，SARS)冠状病毒。对IFITM分子结构及其抗病毒机制的研究将能够帮助我们进一步了解IFN的作用机制，机体固有及适应性免疫之间的联系，以及机体免疫稳态的维持。同时对于个体化治疗方案设定和疫苗研制也有非常重要的价值。

1IFITM基因家族及其演化

1984年，Chen等通过cDNA文库筛选技术首次发现IFITM蛋白家族。进一步研究发现，这个家族包括IFITM1、IFITM2、IFITM3、IFITM5、IFITM6、IFITM7及IFITM10等多个成员。除IFITM5特异性表达于骨细胞，不依赖于IFN进行表达外，其余IFITM家族成员在IFN的调控下在多组织及器官上广泛表达。

脊椎动物IFITM家族按照种系发生可以分为免疫相关性IFITM(immune-relatedIFITM，IR-IFITM)、IFITM5和IFITM10三个亚家族，IFITM1、IFITM2、IFITM3和IFITM5位于11号染色体短臂朝向端粒的26kb区域，IFITM10的定位和功能尚未明确。并且3个IFITM亚家族的功能也相差较大。在此，我们对于脊椎动物IFITM家族基因进行了简单的进化分析，希望揭示各亚家族成员在进化过程中之间的关系及其进化的历程。选取了斑马鱼、野猪、非洲爪蟾蜍、小家鼠、智人、大鼠、牙鲆科、鲤鱼、东北虎、猫、黑猩猩、家牛、绵羊等物种进行种系分析，进行相关的数据分析并制作种系发生树。

2IFITM拓扑结构及其细胞定位

人类和小鼠各表达有5个IFITM家族成员，人类表达IFITM1、IFITM2、IFITM3、IFITM5、IFITM10，小鼠表达ifitm1、ifitm2、ifitm3、ifitm5、ifitm6。IFITM家族成员具有2个疏水区，被一个称为保守性细胞内环结构(conservedintracellularloop，CIL)的保守区分开。IFITM家族属于IFITM1(CD225)蛋白超家族，大约有300个成员，在第一个跨膜区和CIL区具有同源性。

IFITM分子2个疏水区被CIL所分开已经清楚，但对于这两个疏水区是否跨膜或仅仅就只是位于膜内层还有争论。大致可归纳为以下3种模型:IFITM分子C末端(C-terminaldomain，CTD)及N末端(N-terminaldomain，NTD)位于细胞膜外，而CIL位于细胞质;IFITM分子CTD、NTD及CIL都位于细胞质膜上及胞质区，并且C端及N端都无跨越细胞膜脂质双分子层;IFITM分子CTD位于胞膜外，而NTD及CIL位于细胞质膜上及胞质区。虽然每一种模型都有各自的理论依据，但还需要更加充实的实验来证明。早期的研究发现:IFITM3分子CTD和NTD能够与细胞外抗体结合，推测IFITM3具有2个跨膜区。质谱分析(massspectrometry，MS)发现，IFITM3分子N端第24位氨基酸-赖氨酸发生泛素化的几率较大，但泛素化只有在其NTD处于细胞质中才会发生。同样，IFITM3分子N末端的酪氨酸(Y20)，在网格蛋白介导的内吞过程中会发生磷酸化，这些资料都支持N端及C端都处在胞质内。

IFITM分子在组织及细胞中广泛分布。IFITM1主要位于细胞膜和早期内体，在胞膜上主要集中于脂筏结构，并能够与细胞表面分子CD19和CD81相互作用。因CD81是HCV的共受体，提示IFITM1可能与HCV入胞存在着相关性。IFITM2、IFITM3主要存在于晚期内体和溶酶体，并且与脑Ras相关蛋白7(Rasrelatedproteinsinbrain7，RAB7)、CD63和溶酶体相关膜蛋白1(lysosomal-associatedmembraneprotein1，LAMP1)共定位。外源性表达IFITM1、IFITM2、IFITM3将会造成其定位发生改变，主要集中在高度酸化、膨胀的晚期内体和溶酶体上，但仍然可以在细胞膜上检测到大量的IFITM1。

3IFITM重要氨基酸残基

IFITM3氨基酸序列上存在一系列保守并在修饰后发挥重要作用的氨基酸位点。IFITM2、IFITM3NTD的21个氨基酸残基具有同源性。这段序列中的酪氨酸(Y20)突变，将会导致抗病毒作用降低50%以上;Y20还参与IFITM3向晚期内体和溶酶体迁移，并且是IFITM2、IFITM3NTD同源序列中重要的氨基酸残基。膜内结构域1(intramembranedomain1，IM1)区N69及CIL区R85、R87、Y99和K104对于抑制IAV至关重要。Y99突变将会降低对于IAV的抑制作用。D56位于IM1上游，可能参与维持膜的拓扑结构的维持。在IFITM所有蛋白中，N69、C72、F75、R85和K104是高度保守的氨基酸，这与它们参与IFITM3的抑制作用的重要性相一致。在CD225同源区内D56、D86和D92非常保守，而且对于IFITM3的表达是必须的，在CD225稳定性维持方面具有重要作用。

4抗病毒活性及机制

IFITM抗病毒活性的确定开始于在流感病毒的研究，Brass等运用功能基因组筛选技术筛选并确定了IFITM1、IFITM2、IFITM3对于甲型流感病毒具有重要的抵御作用，IFITM可被1型和2型IFN诱导表达，并且对于IFN的抑制病毒活性至关重要。Everitt等采用IFITM3基因敲除小鼠模型，发现IFITM3缺乏小鼠在流感病毒感染后发生了暴发性病毒性肺炎，而重新给予IFITM3可以逆转病情。多项研究发现，IFITM在病毒感染早期即可发挥抗病毒作用。首先，IFITM在多个组织中组成性高表达，其抗病毒作用要先于细胞感染后1型IFN的诱导表达。其次，IFN能够诱导IFITM的大量表达，通过旁分泌的方式保护未感染细胞。再次，病毒逃避IFITM抑制作用要比逃避在感染晚期发挥作用的抑制因子要困难的多。例如，HIV-1病毒体传染因子(viralinfectivityfactor，vif)和病毒独有蛋白(viralproteinunique，vpu)在入胞后开始合成，而宿主通过载脂蛋白BmRNA编辑、酶解多肽样3G(apolipoproteinBmRNA-editing，enzyme-catalytic，polypeptide-like3G，APOBEC3G)或骨髓基质干细胞抗原2(marrowstromalstemcellsantigen2，BST2)影响病毒复制与组装，而这些病毒蛋白能够降解抑制性细胞因子。相比较而言，IFITM介导的抑制作用先于感染发生，能够迅速的发挥抑制作用，并且病毒要逃避IFITM的抑制作用，必须携带有某种蛋白能够抵抗IFITM介导的抑制作用。IFITM抗病毒机制还不十分清楚，关于其作用机制的研究主要集中在影响病毒识别、结合及入胞过程。总结关于IFITM分子作用机制的研究，可以归纳为以下4种假说。

4.1“膜硬化”假说

IFITM通过改变细胞膜特性干扰病毒与细胞膜融合。IFITM的空间结构，特别是多个IM1区之间的相互作用将会改变宿主细胞膜的流动性和结合系数，形成一种称为“膜硬化”的模型，进而有效抵御病毒启动融合过程。而且，细胞膜内层嵌入的IM1将会压缩外层膜，产生一种曲度来抵制病毒融合过程中形成的牵引力。膜流动性的降低可能阻断膜表面分子的侧向移动，抑制病毒包膜蛋白与宿主胞膜上一系列受体分子之间的相互作用，从而阻断膜融合，这在IAV入胞机制中得到了充分的研究。而且，因为病毒包膜来自于宿主细胞膜，IFITM同样能够降低病毒包膜的流动性。尽管只是猜测，但却可以解释为什么一些病毒对于IFITM产生免疫，或许这种IFITM耐受病毒的融合过程具有固有的特点(力度、合作性)，这些都使它们能够克服增加的膜硬度。

4.2脂筏假说

IFITM定位于脂筏，能够增加其与细胞膜上多种病毒受体相互作用的几率，从而有效抑制多种病毒入胞。人类表达的IFITM种类仅仅只有5种，可供选择的范围较小，但它们如何能够改变整个细胞膜的状态?一种解释就是:IFITM定位于脂筏，因为这个区域内有大量的病毒受体，IFITM可能选择在病毒黏附和入胞位点大量富集或者能够快速迁移至此位点，就像CD19和CD81一样。通过与脂筏上富集的蛋白相结合能够有效地将IFITM迁移至病毒入胞位点，进而阻断多种病毒而不需要与每一个病毒受体相互作用。

4.3胆固醇迁移假说

IFITM蛋白改变胞内体及溶酶体状态，使其不适宜病毒融合。机制可能是:改变胞内器室膜的脂质含量;器室膜上富集有大量非特异性蛋白水解酶使病毒入胞分子失活;改变v-ATP的活性干扰胞内体酸化过程。有人提出:IFITM蛋白能够改变宿主细胞脂质稳态，造成大量胆固醇迁移至晚期内体，从而阻断病毒融合。其机制可能是:IFITM1、IFITM2、IFITM3能够结合胞质运输蛋白和囊泡相关膜蛋白相关蛋白A(vesicle-associatedmembraneprotein-associatedproteinA，VAPA)。IFITM-VAPA相互作用干扰VAPA与氧固醇结合蛋白(oxysterolbindingprotein，OSBP)相互作用。OSBP能够调节胆固醇运输，并能够结合不同的宿主蛋白，如VAPA。因此，OSBP与IFITM结合VAPA就存在着竞争，高水平的IFITM能够将大量的胆固醇迁移至晚期内体进而阻断病毒融合。然而，胆固醇错误迁移至晚期内体为什么能阻断通过早期内体入胞的病毒，如:HIV-1、HCV和Jaagsiekte绵羊肺逆转录病毒(Jaagsiektesheepretrovirus，JSRV)，现在还不清楚。同样，这个模型不能够完全解释IFITM的特异性，因为IFITM1、IFITM3与VAPA的相互作用并不能驱动过量的胆固醇迁移至某个特定的细胞器。

4.4“陷阱”模型假说

IFITM改变细胞器运输的比例及模式，将病毒诱导进入非融合途径，这被称为“陷阱”模型。在多种细胞系中表达IFITM蛋白后发现:IFITM蛋白能够诱导大的空泡形成，提示其可能影响囊泡运输、融合与溶解。但这些空泡的大小并不与其发挥抑制作用的强弱相关，并且当细胞内IFITM蛋白敲除后，无论细胞内是否有大量IAV进行复制，并没有观察到细胞发生明显的形态学变化。IFITM蛋白广泛地抗病毒作用与其结构密切相关，现在对于IFITM与病毒，IFITM与宿主细胞，以及病毒与宿主细胞之间的关系及相互作用机制还并不是十分清楚，还有待进一步的研究去解答其中奥秘。

5IFITM基因变异与疾病相关性

基因组保持稳定是物种得以繁衍并保持种族特性的基础。而从长远的生物史看，进化过程充满了基因的突变。特别是免疫系统发生的突变将会对于机体的免疫防御、免疫监视及免疫自身稳定产生重要影响。尤其是在ISG及IFN信号系统中出现的变异将会影响IFN对于病毒感染的免疫应答反应。单核苷酸多态性(singlenucleotidepolymorphism，SNP)是最常见的基因变异类型，在人类基因组中大概每1000个碱基就有一个SNP，人类基因组上的SNP总量大概是3×106个。因此，SNP成为第3代遗传标志，人体许多表型差异、对药物或疾病的易感性等都可能与SNP有关。

Everitt等在研究IFITM3影响IAV感染人体的过程中，发现了一种次要等位基因-SNPrs12252-c，其在英格兰和苏格兰当地因H1N1/09感染住院的病人中出现的比例非常高。这种次要等位基因在高加索人中出现的比例较低，而在汉族人中出现较多。牛津大学Zhang等发现:rs12252-C等位基因在严重流感患者中出现的频率较高(严重型流感患者为69%、温和型流感患者为25%)。进一步研究发现:具有rs12252-C等位基因的人群患严重型流感的几率要较普通人增加6倍。表达有高水平rs12252等位基因的人群，如中国人和日本人，更容易出现流感的流行和大流行。因此，对于IFITM家族基因型的研究将会对于临床上相应患者的治疗产生帮助，主要是通过基因型对患者及健康人进行危险分级，从而决定是否对危险者给予适当的干预措施，并为患者提供不同策略的治疗方案。而且，这些结果也说明IFITM的表达水平及发挥作用的程度都将会影响多种IFITM敏感病毒所导致疾病的临床过程。IFITM似乎能够成为未来对于病毒感染性疾病进行个体化治疗的一种靶分子，同样会成为新型疫苗研制的热点。

6展望

IFITM作为机体固有免疫系统IFN效应的重要元件，在病毒性疾病防御过程中发挥作用。由于IFITM参与调节机体固有免疫并联系适应性免疫应答，被视为是抗病毒治疗有效的靶点。它能够抑制多种病毒入胞和复制，这将会影响到未来对于病毒感染性疾病的预防与治疗。但依然存在许多问题，比如对于IFITM机构与功能的联系，IFITM发挥作用的细胞内信号通路，IFITM在病毒感染后的细胞内重新定位及其与紧密连接分子的关系都需要更深层次的进行研究。我们有理由相信，对于IFITM的深入研究会在病毒性疾病的预防与治疗中发挥重要作用。