过表达CXCR4基因对人脐带间充质干细胞迁移的影响研究

放射性肺损伤(radiation- induced lung injury，RILI)是胸部放疗中常见的并发症，严重影响患者的生活质量以及预后。而目前在临床上仍缺少有效的医治手段和方法。近年来大量研究发现，间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)可通过分化替代、旁分泌、免疫调节等方式，减轻或治疗放射性肺损伤。但随着研究的深入，发现外源性MSCs移植到肺脏损伤部位数量较少，这在一定程度上影响了MSCs 更好的发挥其生物学作用。而在关于MSCs 的体外试验及其他器官疾病的研究中，发现在体外给予MSCs 刺激、诱导，或通过基因转染等方法，提高MSCs 上CXCR4 基因的表达后，可增强其向受损伤组织部位的归巢，从而达到提升治疗效果的作用。因此，本研究拟通过体外的transwell 试验，观察经慢病毒转染后，过表达CXCR4 基因的人脐带间充质干细胞(human umbilical cordsmesenchymal stem cells，HUMSCs)是否可提高趋化、迁移能力，为进行后续的动物实验提供一定的理论基础，从而解决输注MSCs 到肺损伤局部数量较少的问题，达到提升MSCs 减轻放射性肺损伤的治疗效果。

1 材料和方法

1.1 一般材料

1.1.1 细胞来源新生儿脐带来源于海军总医院妇产科，经产妇签定知情同意书后，无菌条件下留取剖宫产的足月健康新生儿脐带。参考以往研究报道，通过组织块贴壁法分离和培养HUMSCs，并已对其进行分化检测及流式细胞仪检测其免疫表型，符合MSCs 标准。

1.1.2 试剂DMEM/F12(dulbecco's modified Eagle'smedium/F12)培养基，青霉素，链霉素购自美国Hyclone 公司;胰蛋白酶(Trypsin)购自美国Invitrogen 公司;胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)购自美国Gibco 公司;Transwell 小室(8 μm，24 孔)购自美国Corning 公司;SDF- 1 趋化因子，购自美国SAB 公司(801121);兔多克隆抗-CXCR4 抗体购自武汉博士德生物工程有限公司(BA0761);Dylinght549 荧光二抗购自美国Abbkine 公司(A23320);GAPDH 兔克隆一抗购自美国Abcam 公司(ab9485);HRP 标记羊抗兔IgG 二抗购自普利莱生物技术公司(C1309)。

1.1.3 病毒构建CXCR4 慢病毒载体和阴性对照组慢病毒载体由上海吉凯基因化学技术有限公司协助构建。CXCR4 基因来源人类，GENE ID 为7852，Genebank 编号为NM_001008540。载体为GV287，分子量为10.4 kb，元件顺序为：Ubi-MCS-3FLAGSV40-EGFP。

1.2 方法

1.2.1 慢病毒载体转染病毒转染前2 h，将第3 代HUMSCs 的各个培养瓶内培养液更换为DMEM/F12培养液，使细胞停止分裂，2 h 后更换培养液为HUMSCs 完全培养液，液量减半。加入聚凝胺，每瓶内终浓度达到6 μg/ml。参考以往研究及预实验结果选定MOI 值，按照CXCR4 慢病毒的MOI 为20，对照组慢病毒为10;即CXCR4 慢病毒需1×107 TU，对照组慢病毒需5×106 TU，分别加入后混匀。12 h后吸出含慢病毒的培养液，更换为新鲜培养液。自慢病毒转染72 h 后，通过荧光显微镜，观察HUMSCs表达EGFP 荧光情况并拍照。

1.2.2 免疫荧光检测将正常HUMSCs 组(Normal-HUMSCs)、转染CXCR4 的HUMSCs 试验组(CXCR4-HUMSCs)和对照组(Control-HUMSCs，仅转染EGFP的HUMSCs)接种于直径24 mm 的圆形细胞爬片，放置于6 孔板内，加入HUMSCs 完全培养液，于细胞培养箱，在37℃、5%CO2、饱和湿度条件培养。1 d 后观察各组HUMSCs 贴壁生长，移除培养液，PBS 轻轻冲洗后，加入约2 ml 的多聚甲醛固定6 h。加入正常血清封闭液，室温下孵育30 min，移除血清。滴加稀释的兔多克隆抗-CXCR4一抗抗体(1:200)，4℃避光孵育过夜。PBS 轻轻冲洗，5 min/次×2 次，滴加稀释Dylight549 荧光二抗(1:100)，室温孵育60 min。PBS冲洗，5 min/次×2 次，用含DAPI 甘油封片剂封片。通过激光共聚焦显微镜，观察HUMSCs 荧光表达情况，EGFP 阳性为绿色荧光，CXCR4 阳性反应的荧光为红色。

1.2.3 蛋白质印迹法检测慢病毒转染HUMSCs 后CXCR4 蛋白表达根据蛋白提取试剂盒说明，提取CXCR4-HUMSCs 组、Control-HUMSCs 组和Normal-HUMSCs 组的细胞总蛋白，BCA 法测定蛋白浓度。样本95℃变性3 min，经聚丙烯酰胺凝胶，稳压100 v电泳分离HUMSCs 蛋白样品。转移至硝酸纤维素膜后，用浓度为5%的脱脂奶粉封闭1 h，1×TBST 清洗10 min，重复3 次。分别加入兔抗-CXCR4(1:100)，兔抗-GAPDH(1:2 500)一抗后，4℃孵育过夜。缓冲剂洗膜5 次，清洗掉一抗后，加入HRP 标记羊抗兔IgG 二抗抗体(1:1 000)孵育30 min。用缓冲液清洗膜后，加入增强化学发光剂孵育显色，凝胶成像分析系统摄像。通过Gel-Pro analyzer4.0 软件，分析各组的条带相对密度。

1.2.4 过表达CXCR4 的HUMSCs 的transwell 趋化试验在8 μm，24 孔transwell 小室(corning 公司)的下室，分别加入600 μl 含SDF-1浓度0 ng/ml，100 ng/ml的DMEM/F12 细胞完全培养液;transwell 上室分别接种CXCR4- HUMSCs 组、Control- HUMSCs 组和Normal-HUMSCs 组的HUMSCs 细胞悬液100 μl，细胞密度1×105/ml。将24 孔transwell 小室放置到细胞培养箱(37℃、5%CO2)内孵育12 h。剪切transwell上室底面的聚碳酯膜，去除膜向上一侧未能迁移HUMSCs，PBS 洗涤，重复3 次，避免触及膜的下层，加入多聚甲醛(浓度40 g/L)固定15 min。滴加苏木精染色，10 min 后用PBS 轻轻冲洗聚碳酯膜，洗去染料。光镜下(×200)统计迁移到小室膜向下一侧的HUMSCs 数量，随机抽取5 个视野的均数作为迁移的HUMSCs 数量进行分析。

1.2.5 统计分析SPSS 统计软件对数据进行分析，数据结果用(x±s)表示，多组间比较采用单因素方差分析。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 HUMSCs形态学观察

对脐带组织块进行培养7～10 d 后，通过显微镜观察，可见有少量HUMSCs 沿贴壁的组织块周边长出，形态呈梭形或多角形。大约21 d 后，HUMSCs 数量增长加快，逐渐表现为集落样生长，细胞表现为较为均一的梭形形状，HUMSCs 平行排列，呈旋涡状生长。

2.2 慢病毒转染后HUMSCs的EGFP荧光表达

第3 代HUMSCs 在经慢病毒转染第72 小时后，通过荧光显微镜发现HUMSCs 发出绿色荧光，并且荧光的强度随着时间的延长，逐步增强。在病毒转染后的第96 小时，可观察到目的基因组HUMSCs 与对照组HUMSCs 发出绿色的荧光，通过与光镜下对照，随机观察不同视野拍照比较，慢病毒转染率大于80%。同时慢病毒转染后的HUMSCs 在正常传代之后，仍可观察到明显的绿色荧光。

2.3 免疫荧光检测HUMSCs中CXCR4表达

通过激光共聚焦显微镜检测发现，经慢病毒转染后，目的基因组HUMSCs 可见EGFP 标记所发出的绿色荧光，同时可见经红色荧光标记的CXCR4 蛋白表达;对照组HUMSCs 可观察到EGFP 标记所发出的绿色荧光，而未见表达代表CXCR4 的红色荧光;正常组HUMSCs 未见EGFP 绿色与CXCR4 红色荧光表达。

2.4 Western blotting检测慢病毒转染后HUMSCs中CXCR4蛋白表达

Western blotting 检测发现，经慢病毒转染后，CXCR4-HUMSCs 组细胞中CXCR4 蛋白呈高表达。在检测时未能明显区分出CXCR4-HUMSCs 组细胞中外源性CXCR4 蛋白条带与内源性CXCR4 蛋白表达条带，这可能与目的基因转染所携带的Flag 标签蛋白分子量较小，在聚丙烯酰胺凝胶电泳时不易分离有关。但过表达CXCR4 组条带增粗明显，密度明显增加，明显高于Control- HUMSCs 组和Normal-HUMSCs 组。

2.5 Transwell趋化试验

通过倒置显微镜观察transwell 小室上室聚碳酯膜背面，可见经苏木精染色蓝紫色标记的HUMSCs。在未加入SDF-1 的各组内，通过随机观察5 个视野，发现细胞数无明显统计学差异(平均每个视野细胞个数，Normal：38±5;Control：41±6;CXCR4-HUMSCs：43±4;F=1.2338，P=0.3256)。在加入SDF- 1 后，发现各组HUMSCs 数目较未加入SDF- 1 明显增多，同时经慢病毒转染目的基因CXCR4 组的细胞数明显高于对照组和正常组，差异有统计学意义(平均每个视野细胞个数，Normal：48±5;Control 50±8;CXCR4-HUMSCs：80±7;F=34.9275，P=0.0000)。

3 讨论

因MSCs 具有免疫调节、修复损伤的功能和作用，已引起越来越多的瞩目和关注。目前仍有多种慢性和进展的肺部疾病，缺少有效的治疗方法，而通过静脉输注的干细胞，可通过静脉系统直接到达肺部组织，这使肺脏成为临床使用MSCs 治疗疾病的一个理想器官和部位。通过静脉系统输注MSCs 后，MSCs 可向受损伤组织部位归巢，通过替代受损伤的细胞，旁分泌多种细胞因子，作为输送药物和受损部位所需介质的载体，在治疗肺部疾病中发挥巨大的作用。而随着MSCs 治疗肺损伤的研究深入，发现输注的外源性MSCs 植入到肺损伤局部病灶的细胞数量较少，使MSCs 转化数量和水平将受到限制，认为病灶局部稀少的MSCs 密度，在治疗肺纤维化上可行性不足。XUE 等的研究中发现，仅0.1%的肺细胞来源于植入的MSCs。因此如何提高外源性MSCs 在肺损伤局部的趋化、归巢，增加局部的细胞数量，是干细胞治疗肺损伤研究中需要解决的问题之一。

MSCs 归巢这一特性，使其可向受损伤的局部组织迁移，并发挥修复的作用。当炎症或组织受到损伤后，损伤局部可分泌大量细胞因子，MSCs 受到这些细胞因子的作用，可向受损组织的局部趋化、迁移，增加其在受损组织局部的数量分布。有研究发现，CXCR4/SDF- 1 生物轴在介导外源性MSCs 向受损伤组织局部的趋化性迁移过程中，发挥了重要作用，同时在体外试验中发现，通过多种细胞因子的组合，刺激MSCs，可提高MSCs 细胞膜上表达CXCR4，促进这些MSCs 归巢能力。SDF-1 可在多个器官中持续表达，而CXCR4 是这一趋化因子的特异性受体。在多种成体干细胞的表面发现有CXCR4 表达，体外试验中，随着SDF-1 的浓度梯度增加，MSCs 迁移的能力同时增加。

目前已经在成骨不全、移植物抗宿主病的动物实验研究中，通过慢病毒转染CXCR4，使MSCs 过表达该基因，可以改善MSCs 的归巢，增强疗效。因此我们拟利用慢病毒作为载体，转染CXCR4 基因，使其在HUMSCs上过表达，以通过SDF-1/CXCR4 生物轴作用，增强HUMSCs 向放射线照射后肺损伤局部归巢的能力。本研究中在进行目的基因转染同时，将EGFP同时转染，利用EGFP 可发出绿色荧光的特点，对目的基因CXCR4 进行观察。荧光显微镜下发现，对照组和治疗组HUMSCs 均高表达绿色荧光，说明基因转染成功。为检测目的基因CXCR4 表达情况，通过免疫荧光检测发现，目的基因治疗组的HUMSCs 在表达绿色荧光的同时，可表达代表CXCR4 的红色荧光，而对照组仅表达绿色荧光，正常组均未表达绿色和红色荧光。另外western blotting 检测也证实目的基因组HUMSCs 较对照组和正常组HUMSCs 高表达CXCR4 蛋白。以上提示经慢病毒转染后，HUMSCs 可过表达目的基因CXCR4。同时对转染后的HUMSCs 进行正常传代，发现HUMSCs 形态无变化，仍可有较强的绿色荧光表达。

通过transwell 小室进行趋化迁移试验发现，在不含有SDF- 1 的培养液中，过表达CXCR4 的HUMSCs 相对于正常组和对照组，迁移到transwell上室膜背面的细胞数量无明显统计学差异，而在含有100 ng/ml 的SDF-1 的培养液中，各组细胞的迁移数量增加，其中过表达CXCR4 的HUMSCs 迁移到膜背面的数量较其他两组明显增多。SDF-1 具有较强趋化作用，可与受体CXCR4 特异性结合，构成的SDF-1/CXCR4 生物轴在定向趋化、迁移及募集细胞参与修复的过程中起到了重要作用。在加入SDF-1 后，各组HUMSCs 迁移数量较未加入SDF-1时增加，与以往的研究结果相一致，也说明HUMSCs可通过SDF-1/CXCR4 生物轴作用进行趋化、迁移。而过表达CXCR4 的HUMSCs 在有SDF-1 存在的条件下，其趋化、迁移能力明显较对照组和正常组细胞提高。

本研究中通过慢病毒为载体转染目的基因CXCR4 后，HUMSCs 在SDF-1 的诱导下，定向趋化能力明显较未转染CXCR4 基因的对照组和正常组HUMSCs 增强，迁移到transwell 上室聚碳酯膜背面的细胞数明显增多，说明转染目的基因成功，在体外实验中证明，过表达CXCR4 的HUMSCs 趋化、迁移能力增强。而过表达CXCR4 的HUMSCs 在放射性肺损伤肺组织的归巢作用如何，需进一步验证，而本研究为进行动物实验提供了一定的理论支持。