抗IL-4全人源单链抗体的鉴定

白细胞介素4(interleukin4，IL-4)、IL-13是由2型辅助性T(Thelper2，Th2)细胞、肥大细胞、嗜酸性粒细胞等细胞分泌的细胞因子，与2型炎症反应有关，在多种疾病如哮喘、过敏性皮炎、过敏性鼻炎、慢性阻塞性肺疾病等的发生机制中发挥重要作用。研究显示，IL-4、IL-13具有共同的受体IL-4Rα/IL-13Rα1及信号通路;二者及IL-4Rα基因的多态性与哮喘、过敏等的发生发展密切联系，它们能够影响患者体内IgE的水平、哮喘的严重程度等;此外，在哮喘和过敏性疾病中，IL-4、IL-13及其受体的表达增加，而中和或去除IL-4、IL-13及其受体，可以减轻动物模型的症状。基于此，研制抗IL-4、IL-13双特异性抗体，中和并阻断二者的生物学活性，有可能成为治疗支气管哮喘等过敏性疾病的重要方法。单克隆抗体(monoclonalantibody，mAb)由于其鼠源性，容易引起过敏反应，而全人源抗体由于其编码基因全来源于人，因此避免了鼠源性抗体的人抗鼠抗体(human-anti-mouseantibody，HAMA)反应。但目前，国内外还无全人源抗IL-4、IL-13双特异性抗体上市。本课题组前期已成功构建天然人源抗体文库，本研究欲从中筛选高特异性的抗IL-4全人源单链抗体(single-chainfragmentvariable，scFv)，为后期构建全人源的抗IL-4、IL-13双特异性抗体奠定实验基础。

1材料和方法

1.1材料

pET102/IL-4/BL21菌株由四川医科大学免疫学教研室保存。Ni-NTA亲和纯化系统购自Invitrogen公司;2000bpDNAladder、1000bpDNAladder、蛋白质低相对分子质量(Mr)marker购自TaKaRa公司。大肠杆菌TG1、辅助噬菌体M13K07均购自Gene公司。HRP标记的小鼠抗M13噬菌体mAb购自AmershamBiosciences公司。IL-4蛋白购自北京义翘生物技术有限公司。

1.2方法

1.2.1IL-4的表达纯化取冻存的pET102/IL-4/BL21在Luria-Bertani氨苄青霉素(LBA)平板上划线，37℃过夜培养。挑取单克隆接种到LBA液体培养基中，37℃，200r/min摇菌至A600达0.6左右。加入IPTG，使其终浓度为1mmol/L，30℃培养5h。10000r/min离心5min。采用SDS-PAGE鉴定沉淀后纯化。用8mLNi-denature-GuHCl缓冲液30mL，溶解表达细菌沉淀;旋转震荡至彻底溶解，冰上超声破碎。加入8mL裂解产物到Ni-NTA亲和纯化柱中，4℃结合1h，待自然沉降后流尽液体。用5mLNi-denature-urea重悬树脂，待自然沉降后流尽液体，重复1次。用5mLNi-denature-250洗脱液重悬树脂，待自然沉降后收集蛋白。纯化得到有生物学活性的人IL-4，并进行SDS-PAGE鉴定。

1.2.2抗IL-4全人源scFv的表达划线培养大肠杆菌TG1，37℃孵育24h。挑取单克隆于LB液体培养基中，37℃、200r/min培养至A600为0.5～0.6左右。前期从健康人的外周血淋巴细胞mRNA中扩增人抗体重链(VH)及轻链(Vκ和Vλ)可变区基因，用linker将其连接成人scFv基因并克隆到噬菌体载体pCANTAB25E中，电转化E.coliTG1，构建全人源scFv文库，经3轮富集后，将其稀释至1∶10。取稀释后的噬菌体文库1μL到200μLA600为0.5～0.6的TG1菌株中，37℃感染10min后，涂于Luria-Bertani氨苄青霉素葡萄糖(LBAG，LB含100μg/mL氨苄青霉素和20g/L葡萄糖)的固体培养基中，37℃培养过夜。随机挑取单菌落分别悬浮于LBAG培养基中，于37℃培养至A600为0.2。离心沉淀细菌，用LBA重悬细菌沉淀，加入M13K07至终浓度3×109噬斑形成单位[(plaqueformingunit，pfu)/mL]，37℃静置10min。37℃，200r/min摇菌2h。加入卡那霉素至终剂量为20μg/mL。32℃摇菌过夜。用200mL/LPEG和2.5mol/LNaCl沉淀噬菌体，用1×PBS重悬噬菌体。

1.2.3ELISA筛选噬菌体IL-4纯化蛋白经包被液稀释至10μg/mL，包被于酶标板内过夜。37℃封闭1h，洗板。噬菌体溶液中加入等倍体积封闭液，室温封闭30min，加入至酶标板，37℃孵育1h。洗板后，加入HRP标记的小鼠抗M13噬菌体mAb(1∶5000)，37℃孵育1h，显色，测450nm处的吸光度(A450)值。

1.2.4PCR检测阳性克隆将ELISA检测中A450值高的克隆进行PCR扩增。上游引物为5'-GGCTCGTATGTTGTGTGGA-3'，下游引物为5'-TAGCCCCCTTATTAGCGTTTG-3'。PCR扩增条件为94℃2min，然后94℃30s，55℃30s，72℃1min，30次循环，最后72℃延伸10min。PCR扩增产物进行凝胶电泳、采用BstNⅠ酶切检测其多样性以及测序。1.2.5斑点杂交检测抗IL-4人源scFv特异性取购买的IL-4蛋白1μL(10μg/mL)点硝酸纤维素膜，室温，晾干。用PBST震荡清洗5min×3次。用50g/L脱脂奶粉封闭1h，PBST清洗5min×3次。将膜放入经过封闭的抗IL-4全人源scFv，室温孵育1h。洗膜3次后，加HRP标记的小鼠抗M13噬菌体mAb(1∶10000)，室温孵育1h。洗膜3次后，加入化学发光剂显色、拍照、分析。

2结果

2.1人IL-4的纯化及鉴定

采用Ni-NTA纯化系统，纯化得到有生物学活性的人IL-4目的融合蛋白，包括了两端连接的标签，Mr大小约为27000。

2.2ELISA筛选抗IL-4全人源scFv随机挑取经3轮富集后的噬菌体抗体文库的单个克隆进行扩增，采用ELISA检测表达的单个scFv，阳性率约为14%。

2.3scFv的鉴定

挑取ELISA阳性的克隆，分别进行PCR、BstNⅠ酶切鉴定。PCR结果显示，在约1000bp处有扩增的目的条带，其中第11号克隆扩增条带大小偏小，将其去除。用限制性内切酶BstNⅠ对筛选的阳性scFv基因进行酶切，BstNⅠ酶切位点随机分布于抗体可变区基因中，酶切后用高剂量(30～40)g/L琼脂糖凝胶电泳进行指纹图谱鉴定，通过比较各scFv的指纹图谱，判定scFv序列的多样性。酶切结果显示，除第6株和第8株scFv指纹图谱相同，其余均不同。选取指纹图谱不同的且与IL-4结合能力强的4株scFv进行测序，结果显示前3株的序列正确(序列略)，可用于后续实验。

2.4斑点杂交检测scFv的特异性

将测序正确的3株scFv克隆表达后，用购买的IL-4蛋白进行斑点杂交检测，结果均为阳性。说明这3株scFv均能与IL-4特异性地结合。

3讨论

IL-4与IL-13主要由Th2细胞产生，可以通过共同的受体及其信号转导通路，发挥部分共同的生物学功能:IL-4、IL-13结合到由IL-4受体α(IL-4receptorα，IL-4Rα)/IL-13Rα1构成的异二聚体受体复合物上，诱导多个效应基因的表达，最终引起气道抵抗、黏液分泌、组织纤维化，在支气管哮喘等过敏性炎症疾病中发挥重要作用。因此，在治疗过敏性疾病中，IL-4与IL-13及其受体是极具前景的靶点。Tanaka等研究发现，抗IL-4mAb能够抑制小鼠体内IgE的产生，但不能抑制呼吸道嗜酸性粒细胞的增多及气道高反应性。Kelly等将Poster1013(抗IL-4Rα抗体)用于尘螨诱导的小鼠嗜酸细胞性哮喘，能够抑制IgE的产生和气道重构;Dupilumab(抗IL-4RαmAb)与吸入激素及长效支气管扩张剂联合应用，可以减缓持续性哮喘伴有高水平嗜酸性粒细胞患者的病情恶化。抗IL-13mAb已用于临床，但只针对某一类型的哮喘有效。由此可见，只针对单一靶点的治疗，疗效是有限的，可能是由于IL-4与IL-13表达方式有差异，且各具有多重功能。Kasaian等应用同时针对IL-4与IL-13的拮抗剂，可以减轻小鼠肺部炎症、气道高敏性及IgE的产生。

因此，能够同时封闭IL-4与IL-13的双特异性全人源抗体有望获得更好的疗效，并且由于其编码基因均来源于人，优于鼠源性mAb。从天然人源抗体文库中筛选出的scFv，由于未经过体细胞的高频突变，一般特异性和亲和力都比较低。本研究从前期构建并且经过3轮富集的天然全人源抗体文库中表达并筛选出3株抗IL-4scFv，经斑点杂交检测，均能与人IL-4特异性结合。后期将对其亲和力作进一步鉴定，并通过构建突变文库，获得高亲和力的scFv，为构建全人源抗IL-4、IL-13双特异性抗体奠定实验基础。