多发性脑海绵状血管瘤研究

脑海绵状血管瘤(cerebral cavernous malformations，CCM)是一种中枢神经系统的血管畸形，表现为成团的、窦腔状扩张的血管，管壁无平滑肌层，仅有一层内皮细胞组成，血管瘤间无神经纤维组织。脑海绵状血管瘤患病率约为0.1% ～ 0.5%，包括两种发病形式：家族性和散发性。家族性脑海绵状血管瘤病灶多发，且病灶数量与发病年龄密切相关。主要致病基因为CCM1、CCM2和CCM3。CCM1 位于7 号染色体长臂上(7q11-q22)，CCM2 位于7p13-15，CCM3 位于3q25.2-27。本研究首次发现CCM1 外显子18 的移码突变可导致脑多发性海绵状血管瘤。

1　对象和方法

1.1　研究对象

患者家系来自浙江省，汉族，该对夫妻于1998 年足月顺产一女孩，7 岁病亡，原因不明。2001 年足月顺产一男孩，外院诊断为脑多发性海绵状血管瘤，现意识不清。患者，男性，外院诊断为脑多发性海绵状血管瘤，女方无类似病史。夫妻希望能有健康孩子，于2013 年来我院就诊，选择胚胎植入前遗传诊断(PGD)助孕。

1.2　研究方法

1.2.1　标本采集

采集患者及其丈夫和儿子的外周静脉血4ml，EDTA 抗凝。

1.2.2　基因组DNA 提取

采用盐析法提取外周血DNA。

1.2.3　PCR 扩增

PCR 引物由上海生工生物工程股份有限公司测合成，序列：CATCCCTGTGTATGTAGGAGTG(Sense);GGGCATTAACTG TCCATTTAGC( AntiSense)，反应体系：25μl 2×Taq Mastermix(北京康为世纪生物科技有限公司)，引物各0.5μl，DNA 模板0.5μl，dd H2O23.5μl。反应条件：95℃变性5min ;95℃变性30s ;58℃退火30s ;72℃延伸30s ;30 个循环;72℃延长7min ;4℃保存。1% 的琼脂糖凝胶电泳观察扩增结果。

1.2.4　Sanger 测序

检测合格的PCR 产物送上海生工生物工程股份有限公司测序，测序结果在CCM1 突变数据库比对。

2　结果

经测序比对后发现，患者和儿子CCM1 基因外显子18均发现序列异常，c.2011_2012delA ;p.Asn671Thrfs*36，移码突变，导致密码子提前终止。患者的妻子CCM1 基因外显子18 未发现序列异常。

3　讨论

CCM 发病男女比例为1 ：1，平均发病年龄为30.6 岁。有37% 的患者出现癫痫发作，36% 有出血，23% 伴有头痛，22% 出现局灶性神经功能缺损，10% 无症状[7]。家族性CCM 是常染色体显性遗传病，大约80% 的患者可检测到CCM1/KRIT1、CCM2/MGC4607 或CCM3/ PDCD10 的突变。目前已有超过150 种CCM1、CCM2 或CCM3 的致病突变被检测出。其中CCM1 编码含736 个氨基酸的KRIT1 蛋白，KRIT1 蛋白是一种微管相关蛋白，含有锚蛋白结构域，一个C 端FERM 结构域和三个N 端NPXY 模体，定位于细胞核和细胞质内。KRIT1 作为肿瘤抑制因子发挥作用，其缺失可导致海绵状血管瘤的发生。首次报道的华人家系的CCM1 基因突变为外显子19 的Q698X 终止密码子突变，导致产生截短的KRIT1 蛋白，从而导致CCM 的发生。我们对CCM1 基因进行测序， 患病的丈夫和儿子外显子18 均发现序列异常，c.2011_2012delA ;p.Asn671Thrfs*36，移码突变，导致下游密码子提前终止，产生截短的KRIT1 蛋白，而不患病的妻子则无此突变。检测结果在CCM1 基因突变数据库进行检索分析，c.2011_c.2012delA 改变无报道，该位点改变导致密码子提前终止，临床意义明确。研究结果证明，CCM 的发生可能与KRIT1蛋白单倍剂量不足有关，这与此前文献报道相一致，有助于解释CCM 的发病机制。然而由于该对夫妻年龄偏大(女方39 岁)，通过超促排卵，单精子注射及胚胎胚培养后，没有得到发育到囊胚期的胚胎，没有可进行遗传分析的胚胎，因此未进行遗传学检测。若患者在新的IVF 周期得到可供活检的囊胚，将在胚胎发育的第五天或第六天取外滋养层细胞进行检测，从而筛选出不含此致病位点的胚胎。

综上所述，本研究对脑多发性海绵状血管瘤家系进行了CCM1 基因测序，发现一个新的致病突变位点，位于外显子18 的c.2011_c.2012delA，有明确的临床意义，可作为产前或胚胎植入前遗传诊断(PGD)的依据。