雄激素受体基因CAG、GGN重复片段多态性与指长比的关联性

指长比(digitratios)是指各指(趾)长度的比值，由于大拇指(趾)的指(趾)长很难确定，因此，指(趾)长比(digitratios)主要指的是2D∶3D、2D∶4D、2D∶5D、3D∶4D、3D∶5D。其中研究较多的是2D∶4D(食指与环指长度之比)。Manning等的研究表明，2D∶4D在出生后不会发生变化。2D∶4D的性别差异性在胚胎期就已决定，在出生后会表现出来，并且2D∶4D在整个一生中都是相对稳定的.Manning等在其研究中推测2D∶4D可以反映个体孕期雄激素的暴露水平。许多研究表明，2D∶4D与认知能力、犯罪行为、空间能力、人格特征等心理学及行为学特征相关联，与前列腺癌、乳腺癌、男性不育、精神分裂症、冠心病等多种疾病也存在关联性。Talarovicˇová等研究发现，无论在雄性还是雌性大鼠，胚胎期较高的雄激素暴露水平会导致较低的2D∶4D。Zheng等研究发现，产前的雄激素与雌激素水平会影响小鼠的2D∶4D。雄激素受体(androgenreceptor，AR)基因第1外显子区含有两个可变的N端区域即两个功能性的微卫星多态性位点，1个由CAG重复序列编码的多聚谷氨酰胺序列和1个由(GGT)3GGG(GGT)2(GGC)n编码的多聚甘氨酸(GGN)。AR的CAG/GGN重复次数与AR的转录活性及转录潜能呈负相关。我们分析了AR基因CAG/GGN重复序列多态性与2D∶4D的关联性，探讨雄激素受体基因多态性是否为人类指长发育的生物学基础。

对象和方法

1.研究对象

按照知情同意原则，随机抽取身体健康，彼此之间无血缘关系，3代以上祖居宁夏的685名宁夏医科大学在校学生，其男性294例，平均年龄(20.02±1.28)岁，女性391例，平均年龄(19.25±1.55)岁。

2.方法

2.12D

4D:采用数码相机提取研究对象的左、右手正面照片，学生手背平放在桌面上，手指伸直并拢，在手前方放置注有学生信息的小纸条，在同一高度摄片。去除手指有损伤的样本，记录年龄等其他相关参数，将所取样本存入电脑，用AdobePhotoshopCS3软件进行处理标记各指标的解剖点，打印后用电子游标卡尺测量(精度0.01mm)，记录每只手的两个手指长度均测量两次。分别计算左右手指长比(2D∶4D)的比值。

2.2基因组DNA制备

肘静脉采血2～5ml，EDTA抗凝，并于-20℃贮存，采用北京天根生化科技有限公司的DNA试剂盒提取外周血中的DNA，用紫外分光光度法测定浓度。

2.3基因分型

PCR反应总体积为12.5μl，含2×ReactionMix6.25μl，ddH2O5.125μl，上下游引物各0.25μl，TaqDNA聚合酶0.125μl，模板DNA0.5μl。引物序列及反应条件见表1。将0.5μlPCR产物与0.1μlLIZ500TM和0.5μl的Hi-Di甲酰胺混合后，在ABI3730DNA测序仪(美国AppliedBiosystems公司)上进行检测，使用PeakScanner软件确定STR片段的长度。每例样本的CAG重复次数根据公式n=(扩增产物长度-222bp共有长度)/3推测，每例样本的GGN重复次数根据公式n=(扩增产物长度-150bp共有长度)/3推测。

2.4统计学处理

2D∶4D经均值±2标准差(x±2s)筛选，用独立样本t检验检测2D∶4D在男性与女性个体中的分布差异。用四分位法筛选出较低(1stquartile，Q1)与较高(3rdquartile，Q3)2D∶4D。用相关分析检验ARCAG和GGN两个多态性位点与2D∶4D的关联性。由于AR位于X染色体上，故我们用3种等位基因模式来分析:(1)较短等位基因;(2)较长等位基因;(3)平均等位基因。数据统计分析采用SPSS13.0统计学软件完成。

结果

1.2D∶4D分布

2D∶4D在男性与女性中的分布，女性右手、左手、平均2D∶4D均高于男性(P<0.05，)。在Q1中，女性右手、DR-L、平均2D∶4D均高于男性(P<0.01，表3)。在Q3中，女性右手、左手、右手减左手(DR-L)、平均2D∶4D(Mean)均高于男性(P<0.01)。

2.ARCAG重复多态性与2D∶4D的关联性2D∶4D经四分位数法筛选出Q1与Q3后，ARCAG重复多态性与男性Q1DR-L2D∶4D存在关联性(r=0.280，P<0.05)，与男性Q3平均2D∶4D也存在关联性(r=0.274，P<0.05)。但CAG重复多态性与男性Q1右手、左手、平均2D∶4D及Q3右手、左手、DR-L2D∶4D无关联性(P>0.05)。较短CAG等位基因与女性Q3平均2D∶4D存在关联性(r=0.337，P<0.05)，但与Q1右手、左手、DR-L、平均2D∶4D及Q3右手、左手、DR-L2D∶4D无关联性(P>0.05);较长CAG等位基因与Q3右手及DR-L2D∶4D存在关联性(r=0.238，P<0.05;r=0.175，P<0.05)，但与Q1右手、左手、DR-L、平均2D∶4D及Q3左手、平均2D∶4D无关联性(P>0.05);平均CAG等位基因与Q3平均2D∶4D存在关联性(r=0.236，P<0.05)，但与Q1右手、左手、DR-L、平均2D∶4D及Q3右手、左手、DR-L2D∶4D无关联性(P>0.05)。

3.ARGGN重复多态性与2D∶4D的关联性ARGGN等位基因与男性Q1及Q3右手、左手、DR-L、平均2D∶4D无关联性(P>0.05)。较短GGN等位基因与女性Q1及Q3右手、左手、DR-L、平均2D∶4D无关联性(P>0.05);较长GGN等位基因与Q1右手2D∶4D存在关联性(r=0.204，P<0.05)，但与Q1左手、DR-L、平均2D∶4D及Q3右手、左手、DR-L、平均2D∶4D无关联性(P>0.05);平均GGN等位基因与Q3平均存在关联性(r=0.225，P<0.05)，但与Q1右手、左手、DR-L、平均2D∶4D及Q3右手、左手、DR-L2D∶4D无关联性(P>0.05)。

讨论

Manning等首次报道了ARCAG重复次数与男性右手2D∶4D呈正相关，低CAG重复次数与低2D∶4D预示着高AR活性，推测2D∶4D可以作为预示AR基因变异的一个简单指标。随后有许多关于ARCAG重复多态性与2D∶4D关联性的研究，但结果存在争议性。Hurd等的研究中未发现ARCAG序列重复多态性与左手及右手存在关联性，但发现ARCAG重复多态性与DR-L2D∶4D存在关联性。Butovskaya等未发现AR基因CAG重复序列多态性与右手及DR-L2D∶4D存在关联性，但发现CAG重复序列多态性与左手2D∶4D存在微弱关联性。在其余一些研究中很少发现ARCAG重复序列多态性与左手、右手及右手减左手2D∶4D存在关联性。

Forstmeier等在斑马雀中也未发现ARCAG重复序列多态性与2D∶4D存在关联性。近些年，关于2D∶4D与产前雄激素的关联性及将2D∶4D作为一个反映产前雄激素暴露水平的标志来探索其与孕期雄激素相关的一些心理及生理特征、疾病患病风险的研究就有上百篇。尽管如此，将2D∶4D作为一个反映产前雄激素暴露水平的标志仍然存在争议性，但都缺乏验证。Zheng等的动物实验研究发现，小鼠2D∶4D取决于胚胎期趾长发育过程中雄激素与雌激素的比值，高雄激素或低雌激素水平会导致低的2D∶4D，2D∶4D的性别差异性在胚胎期第17天就开始出现，此研究证实2D∶4D能够作为预示早期发育过程中雄激素暴露水平的一个标志。

Manning等发现，ARCAG重复序列多态性现，ARCAG重复序列多态性与左手2D∶4D呈正相关。本研究发现，ARCAG重复序列多态性与女性右手2D∶4D呈正相关。Zheng与Cohn的动物实验可以解释上述研究的实验结果，较短的CAG/GGN重复次数会导致较高的较高的雄激素活性，从而导致低2D∶4D。尽管如此，上述实验未在左手及右手中发现相同的结果，另外一些研究未发现ARCAG重复多态性与左手及右手2D∶4D存在关联性。究其原因可能是:雄激素代谢活性及敏感性遗传背景差异;样本量的大小;未找到合适的统计方法。

本研究联合运用四分位数法与相关分析，发现较长CAG等位基因与女性右手2D∶4D呈正相关，较长GGN等位基因与女性右手2D∶4D呈正相关，表明AR基因CAG与GGN重复片段多态性与女性右手指长比存在关联性。这一结果支持2D∶4D可以作为孕期雄激素暴露水平标志的假设。我们的研究结果也预示联合运用四分位数法与相关分析可能是揭示AR变异与2D∶4D关联性的一种更好方法。