新乡地区48例RhD阴性汉人RHD基因多样性研究

Rh血型是人类红细胞上30个红细胞血型系统中第二个最具有临床意义的血型系统，仅次于ABO血型，位于染色体1p34.3-36.1，主要由RHD和RHCE两个基因组成，分别编码D抗原和C/c、E/e抗原(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/6007)，具有复杂性和多态性。基因缺失、基因交换、错义突变产生D变异体。D变异体主要包括弱D(weekD)、部分D(partialD)和DEL型(http://www.uniulm.de/～fwagner/RH/RB2/)。弱D由RHD基因编码区碱基突变造成，改变的蛋白质(抗原)位于细胞膜内和膜中，抗原表达完整但是强度减弱。部分D抗原表达不完整，改变的蛋白质(抗原)位于细胞膜外其质量发生变异，与某些抗-D试剂不发生凝集反应。DEL型抗原表达不仅强度减弱，且质量也发生变化，常规血清学方法不能检测到，只能用吸收放散试验才能检出。Rh血型抗原尤其是D抗原具有很强的免疫原性，D抗原不合可以免疫刺激机体产生Rh抗体，引起溶血性输血反应以及新生儿溶血病。因此，RhD抗原表型鉴定已列为临床输血常规检查项目。血清学RhD初筛为阴性，间接免疫球蛋白(IAT)确认后行RHD基因分型以鉴定是否为变异型。RhD阴性受血者尽可能输注RHD全缺失型血液，若输注D异体血液(含有D抗原)，可刺激受血者免疫产生RhD抗体，导致临床发生输血不良反应。通过新乡地区RhD阴性无偿献血者RHD基因多态性分析，了解本地区RHD基因变异体分布情况，构建本地区RHD基因变异体资料库，有助于指导临床进行RhD阴性受血者科学、合理、安全、有效输血。

1材料与方法

1.1仪器和试剂

(1)仪器:血清学专用离心机、KA-2200小型台式离心机型(日本久保田公司)、核酸蛋白测定仪(美国Eppendorf公司)、PCR扩增仪(德国WhatmanBiometra公司)、电泳仪(北京六一机器厂)、凝胶成像系统(美国UVP公司)。

(2)试剂:抗-A、抗-B、IgG单克隆抗-D、抗-E、抗-C、抗-c、抗-e、抗球蛋白试剂均由上海血液生物医药有限责任公司提供;IgG+IgM抗-D(美国Immucor公司)，IgG+IgM抗-D(DIAGAST公司)、血液基因组提取试剂盒(北京康为世纪生物科技有限公司)、人类红细胞RHD阴性鉴定基因检测试剂盒(天津市秀鹏生物技术开发有限公司)、dNTP(北京天根生化科技有限公司)、DNATaq酶(美国Promega公司)、M2000(大连宝生物工程有限公司)。

1.2血样和血清学检测

2014年9月-2014年12月间新乡市血液中心在37400份血液中通过血清学试验筛选出RhD阴性供血者48例(RhD阴性率为0.128%)，各抽取EDTA-K2抗凝血2ml，-20℃保存。所有血样再次用微量板进行RhD抗原初筛，同样用3种不同厂家的抗D试剂通过间接抗球蛋白证实为RhD阴性。

1.3基因组提取及PCR扩增按试剂说明书提取

基因组DNA，dsDNA浓度范围在30～100ng/μl，A260/A280的OD值在1.7～2.0之间。PCR扩增体系按说明书配制混合液(80μldNTP-Buffer工作液+0.8μlTaq酶+10μlDNA)，再向每个引物孔(1～8孔)各加入10μl上述混合液。PCR扩增程序:96℃预变性2min，96℃变性20s，68℃60s，共5个循环;96℃变性20s后，65℃50s，然后72℃45s，10个循环;96℃变性20s后，62℃50s，然后72℃45s，18个循环;最后72℃延伸5min，4℃保存。然后取10μl扩增产物在2%的琼脂糖凝胶(含EB)电泳，120V电泳18min，全自动凝胶成像仪成相保存结果。RHD阴性鉴定基因检测试剂盒结果分型1。

1.4统计学分析RH阴性变异型的频率采用直接计数法。

2结果

2.1Rh阴性PCR-SSP结果通过PCR-SSP(序列特异性引物聚合酶链反应)对48例RhD阴性无偿献血者进行RHD基因鉴定，所扩基因片段大小依据基因分型结果参照表判断RHD基因型，发现新乡地区存在RHD全缺失型、DELRHD1227A杂合型、RHD-CE(2-9)-D和不确定型。48例RhD阴性无偿献血者RHD基因分型。

2.2RHD基因频率和ABO、Rh表型分布48例新乡地区RhD阴性无偿献血汉人RHD全缺失型30例(62.5%)，DELRHD1227A杂合型12例(25.0%)，RHD-CE(2-9)-D4例(8.3%)，2例有EXON1、845G、D9特异性扩增，不能判断其变异类型。RHD变异型ABO和Rh抗原表型分型发现A型12例(25.0%)、B型24例(50.0%)、O型12例(25.0%);ccdee29例(60.4%)、Ccdee14例(29.2%)、CCdee3例(6.3%)、ccdEe2例(4.2%)。

2.3不同种族和地区人群的RHD变异型差异。

3讨论

血清学技术检测Rh血型，在预防新生儿溶血病和避免临床输血不良反应中起着很重要作用。临床由于抗D单克隆抗体试剂特异性识别相应抗原表位所限以及胎儿RhD血型判定时标本采集困难，造成D变异型、DEL及weakD往往难以得到正确结果。Rh血型系统具有RHD、RHCE双基因结构，各由10个外显子组成，二者有43个碱基有差异，其中第1、2、8外显子序列基本一致，并且RHD、RHCE相隔很近(约有3万bp)，在RH座位上方向相反，同源基因之间发生交换的机率很大。D基因完全缺失(10个外显子全部缺失)导致了D抗原的不表达，Rh真阴性;或者D基因的部分缺失(有两边缺失和中间缺失，基因交换形成的融合等位基因)导致D抗原的不表达，如RHD-CE(1-9)-D、RHD-CE(3-7)-D、RHD-CE(8-9)-D等;D基因完整存在，但碱基突变、缺失、mRNA拼接位点变异等导致D抗原不表达，如RHD1227A、RHD(IVS3+1g﹥a)、RHD(M2951)等。国内外RHD基因变异型分子结构(基因缺失、基因交换、错义突变)存在着地区和种族差异。本研究发现，新乡地区RHD基因型全缺失型(62.5%)与YeSH等研究的结果一致，由错义突变引起的DELRHD1227A杂合型占25.0%，RHD与RHCE基因交换引起的RHD-CE(2-9)-D占8.3%，与中国北方汉族人群相符，但与YeL等报道的中国南方地区差异性较大，上海地区主要表现为部分D变异体DVI。RHD(1227G>A)频率与国外ScottSA等报道的高加索人有差异，变异型类型与CruzBR等报道的常见的变异型弱D4.2(DAR)及St-LouisM等报道的DELRHD*(93-94insT)相比，本地区与国外RHD变异类型及频率差别较大。且RHD变异型可引起同种免疫反应，DELRHD*(93-94insT)作为供者输入D阴性受者体内产生抗-D，RHD*DAU4(部分D，血清学检测为D+)作为受者输注RHD+红细胞后产生同种抗体，发生溶血性输血反应。

Rh阴性表型频率白种人占15%～17%，非洲人占5%，亚洲人少于0.5%，本地区占0.128%，为了保证输血安全，加拿大血液中心将所有的D变异型作为作为阳性供者，但就本地区而言，D阴性表型比率较低及变异型与国外的差异，受者RHD变异型不产生同种免疫时，可输注D+血液，减少对Rh阴性血的需求，节约Rh阴性血。我们将进一步研究本地区的DEL作为受者时是否可作为阳性血，合理利用血液资源。

对本地区Rh阴性无偿供血者行RHD基因分型，进而正确区分RH全缺失型、部分D、弱D和DEL，以及发现新的RH变异型，以避免RHD错误定型，对不能明确其变异类型的样本我们将进一步测序。由于只统计了新乡地区近4个月的无偿献血者，受此时段RhD阴性献血人群的限制，我们只收集到48例RhD阴性标本，Rh阴性表型频率较低(0.128%)，不足以完全代表本地区RHD变异类型，但也能反映新乡地区存在着RHD基因型全缺失型、DELRHD1227A、RHD-CE(2-9)-D等RHD变异型，后继可继续增加无偿献血者个人资料，完善本地区RHD变异型资料，此为血液中心贮血和RhD阴性患者紧急输血提供帮助。