黑龙江地区蒙古族人群HLA-A、B、DRB1基因多态性研究

HLA系统是迄今所知人类基因中多态性最复杂的遗传系统，其等位基因频率及其连锁不平衡特点在不同种族、民族、地域存在明显差异。其多态性及分布差异是自然选择造成的，它保证了种群能产生对各种病原体特异的免疫应答，以维持群体的稳定性。因此，一个群体高分辨水平的HLA多态性的研究对组织器官移植寻找合适供者、群体遗传学、人类学和法医学至关重要。全世界蒙古族人约为1000万人，主要分布在中国、蒙古国(约280万)、俄罗斯(约90万)3个国家。中国的蒙古族人口为581万人(2000年人口普查)，在我国少数民族人口里排列第6，其主要分布在内蒙古自治区、东北三省、新疆、河北、青海，黑龙江地区蒙古族人口约14万人。目前有关蒙古族HLA基因多态性在中国人群中的报道大部分是低分辨分型数据的研究，研究采用SBT分型技术对67例中国干细胞库黑龙江地区蒙古族捐献者进行HLA-A、B、DRB1高分辨分型，获得HLA群体高分辨分型数据，经统计分析得出其等位基因频率及分布特征。

1材料与方法

1.1标本来源

67份标本来自黑龙江地区健康、无血缘关系、18～55周岁蒙古族造血干细胞捐献者。

1.2主要试剂和仪器

TIANampBloodDNAKit血液基因组DNA提取试剂(美国Tiangen公司)，PCR-SBT基因分型试剂盒(德国ROSE公司)，BIO-RADPCR扩增仪，3730xlDNAAnalyzer测序仪。

1.3实验方法

采用外周静脉EDTA抗凝血样，TIANampBloodDNAKit血液基因组DNA提取试剂提取基因组DNA。采用PCR-SBT方法，分别对HLAⅠ类基因A、B位点的第2、3和4外显子正反方向及HLAⅡ类基因DRB1位点的第2外显子正反方向测序，经纯化、测序，结果采用ATF-loader序列分析软件进行分析，获得高分辨分型结果。

1.4统计学处理

1.4.1等位基因频率及熵值(Entropy)的计算采用直接计数法和最大数学预期值算法(EM)通过Arlequin3.1软件分别计算等位基因频率和单体型频率，同时对各基因位点作Hardy-Weinberg平衡检验。在HLA领域中，频率分布的熵值是对1个或1组紧密连锁的HLA基因座位多态性高低的度量，计算公式:E=-Σfi×log2fi(fi为HLA基因或单体型的频率)。

1.4.2最小群体数量的估计为了得到可靠地单体型频率，需要一定数量的群体。如果在由n个个体组成的群体中，某单体型只出现一次，该单体型频率HP=1/2n，但并非所有频率≥1/2n的单体型都是可靠的。由此在随机人群中，如果要求有P的把握在群体中检测到该单体型，所需要的群体最少数量为N，N=log(1-P)/log(1-2HP+HP2)。如果把P设置在95%区间，则N=-1.3010/log(1-2HP+HP2)。

2结果与分析

2.1HLA-A、B、DRB1等位基因频率及熵值67份标本共检测到HLA-A、B、DRB1基因座位上80种HLA编码基因。HLA-A、B、DRB1基因座分别检出等位基因20、37和23个。A、B、DRB1基因座HW吻合度的检验结果均为P>0.05，表明本研究来源群体的基因分布符合Hardy-Weinberg平衡定律。各座位上等位基因频率的分布情况显示，E(B)>E(DRB1)>E(A)，表明HLA基因座位B、DRB1、A的多态性程度依次降低。

2.2最小群体数量的估计最小群体估计调查的群体样本数为67人，只出现一次的基因型频率为HP=1/(2×67)=0.007463。如果要使该数据的值有95%的把握可以检出，那么至少需要调查的群体数为:N=log(1-P)/log(1-2HP+HP2)=200人，即至少要调查200人，才有95%的把握认为频率为0.007463的单体型是可靠的。按此推论，调查67人可以有95%的把握认为单体型频率大于0.022108是可靠的。小于此数值的单体型频率，则需要在更大样本的群体资料中进行估计。因此，讨论的HLA-A、B、DRB1基因座中分别有15、20和14个等位基因有95%的把握认为单体型频率是可靠的;有5、17和9个等位基因需要在更大样本的群体资料中进行讨论。

3讨论

研究讨论了黑龙江地区67例蒙古族人群的HLA-A、B、DRB1高分辨等位基因多态性及其分布情况，共检测到80个HLA-A、B、DRB1等位基因，其中以B座位的多态性最为丰富，不仅是因为B座位比A、DRB1座位存在数目更多的等位基因，还因为B座位中常见等位基因并非处于绝对优势地位，其>0.1的常见等位基因累计频率为0明显

研究所得数据是我国少数民族基因多态性研究的重要补充，同时分析HLA-A，B，DRB1等位基因多态性的特征可为估计捐献者资料的例数对患者查询的满足程度、与患者查询的匹配几率以及与移植成活或预后的关系等研究提供依据。