天津市女性MTHFR、MTRR 基因型和等位基因频率分布

出生缺陷(birth defects，BD) 是我国严重的公共卫生问题和社会问题，每年新增出生缺陷约90 万例。叶酸摄入不足或不能被机体有效利用是导致出生缺陷的主要原因。5，10- 亚甲基四氢叶酸还原酶(5，10-methylenetetrahydrofolate reductase，MTHFR) 和甲硫氨酸合成酶还原酶(5-methyltetrahydrofolate-homocysteinemethyltransferase reductase，MTRR)是参与体内叶酸代谢的关键酶，其基因多态性会影响体内叶酸及同型半胱氨酸水平，与神经管畸形、复发性流产、妊娠期高血压等疾病的发生密切相关，严重影响母婴健康。本研究针对天津市女性，开展流行病学调查，旨在阐明本地区人群的遗传特征，为个体化的孕期保健提供依据。

1　资料与方法

1.1　临床资料

选取自2012年5月至2015年5月在天津市妇女儿童保健中心进行孕前与孕期检查的健康女性，入组对象共467例，平均年龄(29.81±4.15)岁。根据知情同意原则，采集口腔粘膜细胞。

1.2　方法

利用硅胶吸附法收集口腔粘膜上皮细胞，提取样本的基因组DNA。通过荧光定量PCR 技术(仪器购于美国ABI 公司)，检测MTHFR C677T、A1298C 和MTRR A66G的基因多态性。反应体系(10 μl)：20 ng/μl DNA 模板(1μl)，Taqman Universal Master Mix(5 μl)，Taqman-MGB探针(见表1)(0.5 μl)，DEPC 水(3.5 μl)。反应条件：95℃预变性10 min，92℃变性15 s，60℃延伸1 min，20 个循环;89℃变性15 s，60℃延伸90 s，30 个循环。反应结束后在ABI7900 型荧光定量PCR 仪上读取样品孔中的终点荧光，采用分析软件SDS 2.3 确定各个样本的基因分型结果，采用Hardy-Weinberg 平衡分析MTHFR C677T、A1298C和MTRR A66G 基因多态性。

1.3　统计学分析

SPSS19.0 软件进行SNPs 的Hardy-Weinberg 平衡的统计学分析，Haplo View4.2 软件进行单倍型结构和LD 水平分析。计数资料采用率表示，对基因型及等位基因的频率进行χ2 检验，检验水准α=0.05，以P < 0.05 为差异有统计学意义。

2　结果

2.1　Hardy-Weinberg平衡分析

MTHFR C677T、A1298C 和MTRR A66G 基因多态性，检验结果符合Hardy-Weinberg 遗传平衡(χ2 分别是0.79、0.21、2.19，P 均> 0.05)，表明样本具有本区域的群体代表性。

2.2　天津市女性MTHFR、MTRR基因型和等位基因频率与不同地区女性比较

天津市女性MTHFRC677T 位点的基因型频率与德阳、松滋、湘潭、昆明、惠州、南宁、琼海的差异有统计学意义(P 均< 0.01);A1298C 位点的基因型频率与南宁、琼海的差异有统计学意义(P 均< 0.05);MTRRA66G 位点的基因型频率仅与琼海的差异有统计学意义(P< 0.05)

天津市女性MTHFRC677T 位点的等位基因型频率与德阳、松滋、湘潭、昆明、惠州、南宁、琼海的差异有统计学意义(P 均< 0.01);A1298C 位点的等位基因型频率与南宁、琼海的差异有统计学意义(P 均< 0.05);MTRR A66G 位点的等位基因型频率仅与琼海的差异有统计学意义(P < 0.05)

2.3　天津市女性MTHFR C677T和A1298C两位点的连锁情况及单倍型分析

天津市女性MTHFR C677T 和A1298C 两位点组合情况(表2)显示，TT/AA 组合所占比例最多，达32.9%，CT/AA 组合次之，占30.8%，不存在TT/CC 与CT/CC 两种组合，具有一定的地区代表性。通过单倍型分析，结果显示，天津市女性中存在4 种组合：TA(56.5%)、CC(28.7%)、CA(14.7%)、TC(0.1%)。两位点间高度连锁不平衡(D′=0.984，r2=0.22).

3　讨论

出生缺陷的发生受环境、营养和遗传因素的共同影响。作为参与体内叶酸代谢的关键酶，MTHFR C677T 和A1298C 位点的多态性会降低酶活性，影响叶酸代谢和利用，与神经管畸形、唇腭裂、先天性心脏病、唐氏综合征等出生缺陷，以及妊娠期高血压、复发性流产等孕期疾病密切相关。导致MTHFR 酶活性降低。双杂合子个体677CT 和1298AC 存在协同作用，与仅含C677T 突变的个体相比，同型半胱氨酸浓度显著升高。本研究显示天津女性这两个位点的双杂合子占16.4%。

在张婷等人所报道中，通过677CT 和1298AC 连锁不平衡分析发现，贵州地区布依族和苗族两位点间存在完全连锁不平衡现象(D′=1)，而侗族却未见已报道的两位点连锁不平衡现象，本研究表明天津市女性MTHFRC677T 和A1298C 两位点间(D′=0.984，r2=0.22)为高度连锁不平衡。天津女性易感基因MTHFR C677T、A1298C和MTRR A66G 位点多态性与其他地区女性的频率存在差异。研究表明，677T 基因型孕龄女性在低叶酸饮食及未服用叶酸增补剂的情况下，其胎儿唇腭裂的发生风险均会增加，若以上两种情况同时存在，则风险进一步增高。反之，如果能够补服叶酸增补剂、提高饮食中叶酸的含量则可以降低胎儿唇腭裂的发生风险。

本研究对MTHFR C677T 和A1298C 两位点均进行了单倍型连锁不平衡研究。理论上，连锁不平衡性随着遗传距离的增加而下降，通过两位点中每两个位点之间的单倍型连锁不平衡，我们发现根据r2 值(0.22)可知677-1298其连锁强度不高。因为单倍型的保留不仅可以自发性地保留同时也可以通过与其它等位基因重组来延续。

目前的孕期保健措施是从孕前3 个月到孕早期3 个月，每天增补叶酸0.4mg。对于那些由于易感基因多态性造成叶酸代谢障碍的人群，在补充相同剂量叶酸的情况下，血浆叶酸的浓度较正常人低，同型半胱氨酸水平明显升高。因此，通过对育龄女性进行遗传筛查，针对存在叶酸代谢障碍的遗传风险人群，采取增加营养素补充、加强红细胞叶酸水平监测、提高产前筛查和孕期管理依从性等干预措施，是有效达到出生缺陷及孕期疾病一级预防目的的重要方法，也是提高人口素质的必要手段。