结节性硬化症基因新突变鉴定

　　结节性硬化症(tuberoussclerosiscomplex，TSC)是一种常染色体显性遗传病，以全身多种组织器官出现错构瘤样增生为特征，最易累及脑部、皮肤、和肾脏。该疾病具有遗传异质性，致病基因包扩TSC1(MIM605284)和TSC2(MIM191092)。TSC1基因定位于9q34.13，编码含1164个氨基酸、分子量为130kD的蛋白产物，称为错构瘤蛋白(hamartin)。TSC2基因定位于16p13.3，编码1807个氨基酸、分子量为200kD的蛋白产物，称为马铃薯球蛋白(tutberin)。Tuberin与hamartin蛋白在胞内形成复合物，该复合物通过tuberin蛋白调节哺乳动物雷帕霉素靶蛋白复合体(mTOR)信号转导通路从而调控细胞的生长和增殖。或基因突变均TSC1TSC2可导致tuberin与hamartin复合体功能缺陷，mTOR信号通路异常激活，从而导致结节性硬化症的发生。根据人类基因突变数据库专业版的统计，截止至2015年4月，该数据库共记录了TSC1基因突变303种，TSC2基因突变969种。TSC1和TSC2突变类型均以碱基置换导致的错义和无义突变为主，TSC2基因易发生大片段的缺失及基因重组，但这在TSC1基因较为罕见。无论是散发病例还是家系患者，致病突变多见于TSC2基因。此外，两种基因无明显的突变热点区域，突变广泛分布于编码区。本研究采用PCR和DNA测序的方法对一例中国汉族结节性硬化症家系的先证者进行TSC2和TSC1基因的突变检测，旨在对该家系进行致病突变筛查和进一步确定诊断，并为TSC致病机制的研究提供依据。
1　材料和方法
1.1研究对象
我们收集了1个中国汉族结节性硬化症家系中先证者的外周静脉血样，该患者18岁，女，7-8岁发病，具有面部血管纤维瘤和癫痫症状，为家族遗传性，先证者父亲也为受累患者，未能收集到其他临床资料。患者均签署知情同意书。
1.2基因组DNA提取
取患者III-1枸橼酸钠抗凝处理的外周静脉血250μl，选用UniversalGenomicDNAExtractionKitVer.3.0(TaKaRa)试剂盒提取基因组DNA，置于-20℃保存。
1.3PCR扩增致病基因及测序分析
在UCSC网站获得TSC1及TSC2基因的DNA序列，使用PrimerPremier5.0软件设计覆盖该基因编码区(包括外显子和内含子交界区)的引物，引物均由生物工程(上海)股份有限公司合成。其中扩增TSC2基因外显子15的引物序列为：上游5'-GAATACCGACTGCCATTTCT-3'，下游5'-AGGTGGGAGTGTGAAGAATG-3'。首先对先证者III-1进行检测，PCR扩增该患者TSC2和TSC1基因的全部外显子，PCR反应2+体系为2×GCBufferI(MgPlus)25μl，dNTPMixture(各2.5mmol/L)8μl，上下游引物终浓度为0.5μmol/L，TaKaRaLATaq2.5U，基因组DNA约100ng，加ddHO至50μl。PCR产物进行1.5%琼脂糖凝胶电泳2·150·解剖科学进展2016年第22卷第2期Fig1.PedigreeofTSCfamily检测，切胶纯化后对PCR产物进行Sanger测序分析。利用UCSC数据库Blat功能对测得的DNA序列进行比对分析。
1.4核酸限制性内切酶检测验证
对未报道的新突变c.1556C>T，在患者及120名无关正常个体中进行酶切验证，以排除多态性。采用错配引物方法，使突变的个体引入限制性内切酶的酶切位点。用错配引物对先证者及120名正常个体进行扩增，PCR产物经过限制性内切酶酶切消化过夜，酶切产物进行8%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳。
1.5片段克隆测序
由于未获得先证者双亲外周血样本，为鉴定先证者样品中的两个突变是分别继承自父母双方，还是均来自先证者的受累父亲，利用TaKaRaAgaroseGelDNAPurificationKit，对先证者的TSC1第15外显子PCR产物进行纯化，纯化后的PCR产物与pMD18-T载体16℃连接过夜，转化DH5α感受态细胞，取150ul菌液均匀涂布于氨苄青霉素-LB平板培养基，37℃过夜培养，利用载体通用引物M13-47和TSC1基因外显子15的下游引物进行菌落PCR，阳性克隆扩增培养后，送博迈德生物技术有限公司进行测序。
2　结果
2.1DNA测序结果
DNA测序结果显示先证者TSC1基因第15外显子有两个位点突变，第一个突变是错义突变c.1556C>T，该突变导致第519位氨基酸由苏氨酸变成异亮氨酸(p.Thr519Ile)，检索基因突变数据库和相关文献，该突变为国际上尚未报道的新突变;第二处突变是微小缺失突变c.1888_1891delAAAG，该突变导致第630位氨基酸由赖氨酸变为谷氨酰胺并且发生移码从而形成提前的翻译终止密码(p.Lys630Glnfs*22)，为已经报道过的致病突变位点。该先证者TSC2基因测序结果未见异常。
2.2限制性内切酶验证结果
设计错配引物，使c.1556C>T突变的个体引入一个BamHI酶切位点。应用错配引物对先证者及120名正常个体进行扩增，PCR产物经过BamHI酶切，结果显示患者的PCR产物部分被切开为226bp和26bp，由于26bp片段过短，因此患者在凝胶上显示为252bp和226bp两条条带，而正常个体均不被切开，显示为252bp的单一条带。
2.3片段克隆测序结果
先证者第15外显子DNA克隆测序结果显示，两个突变均来自于同一个等位基因。
3　讨论
TSC是一种累及多个系统的遗传性疾病，可发生多个器官的错构瘤，包括脑，心脏，肾脏，皮肤，眼部，肺和肝脏等，发病率约为1:10,000至1:6,000，外显率高，但TSC临床表现变异较大，不同患者及同一家系内不同个体临床变现也存在差异，因此疾病预后情况可有明显差异。该疾病主要依靠临床表现和影像学检查进行诊断，因此分子遗传学分析可为患者提供早期诊断，早期干预改善预后。本研究对一个结节性硬化症家系先证者进行TSC1和TSC2基因突变分析，发现该患者同时存在TSC1基因的两个突变，即c.1556C>T和c.1888_1891delAAAG。错义突变c.1556C>T，为国际上首次报道，该突变导致519位的极性的苏氨酸被疏水的非极性异亮氨酸代替。粘着斑激酶家族互作蛋白(FIP200)可通过与TSC1的第403-787位氨基酸区域相互作用进而调控TSC1-TSC2复合体的功能，上调S6激酶的磷酸化水平，该突变位于FIP200与TSC1的结合区域，很可能影响二者的结合。本例另一微小缺失突变c.1888_1891delAAAG，根据LeidenOpenVariationDatabase数据库统计，该突变被报道过41次，可能为高频突变，突变后影响了开放阅读框造成移码，预测将在第652位产生提前的终止密码。TSC1通过C末端(693–1164位氨基酸)与TSC2相互作用形成TSC1-TSC2复合体，分析该突变一方面可能引起无义突变介导的mRNA降解，另一方面也可能产生截短蛋白，丢失了与TSC2相互作用的结构域，无法与TSC2形成复合体，进而导致mTOR信号途径异常。该家系的两个突变位点是否分别或共同起到致病作用，仍需进一步在细胞或动物水平进行研究。
克隆测序结果显示该患者的两个突变位于同一个等位基因上，符合常染色体显性遗传方式，因此这两个突变很可能是导致该家系患病的致病突变，同一患者同一个TSC1等位基因上存在两个突变情况较为罕见，本研究扩充了TSC基因突变数据库，同时为患者提供了基因诊断，明确了病因，对该家系其他成员的诊断和遗传咨询具有重要意义。