CYP3A41G依赖的CYP3A4内含子10启动的真核表达载体构造

CYP3A4是CYP3A亚家族中最主要的成员，占P450酶系总量的30%～40%，主要分布在肝脏和肠道。它参与了许多药物和外源性毒物的氧化代谢，可代谢约50%的临床常用药物。研究表明，人肝脏中CYP3A4的表达及其活性存在着明显的个体差异，并且这种差异90%与遗传多态性有关。CYP3A4*1G(rs2242480)是CYP3A4内含子10中的一个单核苷酸多态性(SNP)，其等位基因频率在亚洲和南非人群中超过20%。研究表明CYP3A4*1G与阿托伐他汀、环孢霉素、他克莫司、芬太尼等药物的剂量、疗效及药代动力学改变有关。前期体外研究发现，在HepG2细胞中CYP3A4内含子10具有启动子活性，并被CYP3A4*1G等位基因依赖性调控，但CYP3A4*1G调控的CYP3A4内含子10与CYP3A4基因表达之间的关系尚不清楚。该研究分别构建了由CYP3A4启动子和CYP3A4*1G依赖的CYP3A4内含子10启动的CYP3A4真核表达载体，并将其转染入HepG2细胞，检测CYP3A4mRNA的表达情况。

1材料与方法

1.1材料

pcDNA3.1/Hygro(+)空质粒、pGEMCYP3A4为浙江大学药学院药物分析与药物代谢研究室曾苏教授惠赠。携带CYP3A4*1G(GG/AA)的基因组DNA来自河南汉族健康志愿者，由郑州大学基础医学院药理教研室保存。质粒小提试剂盒(Axygen公司)，胶回收试剂盒(天根生化科技有限公司)，限制性内切酶(NEB公司)，T4DNA连接酶(TaKaRa公司)，PrimeSTARMaxDNA聚合酶、感受态DH5α和反转录试剂;TriPureIsolation试剂(罗氏公司);SYBRSELECTMASTERMIX(Life公司)、Invitrogenlip2000。PCR引物由宝生物工程(大连)有限公司合成。仪器设备主要有超净工作台、PCR扩增仪、Nano-Drop2000c分光光度计、37℃摇床、离心机、水平电泳仪、ABI7500Fast实时荧光定量PCR仪等。

1.2质粒扩增

将pcDNA3.1/Hygro(+)空质粒、pGEM-CYP3A4质粒分别转化到DH5α感受态细胞内，使其随细胞的繁殖而复制扩增，然后用质粒小提试剂盒提取质粒并测定浓度备用。

1.3目的片段的扩增、纯化及回收根据NCBI数据库中CYP3A4cDNA(NM_017460.5)设计引物，在上、下游引物的5'端分别加上EcoRV和XbaⅠ酶切位点和保护碱基。根据NCBI数据库中CYP3A4基因(AF280107)5'端上游启动子区序列设计引物，在上、下游引物的5'端分别加上MluⅠ和NheⅠ酶切位点和保护碱基。根据CYP3A4基因(AF280107)内含子10全长序列设计引物，在上、下游引物的5'端分别加上MluⅠ和NheⅠ酶切位点和保护碱基。PCR引物序列见表1。扩增CYP3A4cDNA所用模板为pGEM-CYP3A4质粒DNA，扩增CYP3A4启动子、CYP3A4内含子10所用模板为人类基因组DNA。PCR反应体系:PrimeSTARMaxDNA聚合酶(2×)25μL，上、下游引物各3μL，模板DNA4μL，超纯水补至50μL。反应条件为98℃10s，65℃15s，72℃2min，30个循环。PCR产物经10g/L琼脂糖凝胶电泳后，按胶回收试剂盒说明书操作，回收目的片段并测浓度。

1.4pcDNA3.1-3A4重组质粒的构建

用EcoRV和XbaⅠ双酶切空质粒pcDNA3.1/Hygro(+)、PCR产物CYP3A4cDNA片段，纯化回收后测DNA浓度，16℃连接过夜。连接产物转化到DH5α感受态细胞，涂在含氨苄青霉素(100mg/L)的LB固体培养基上，根据培养板菌落生长情况挑取单克隆，提取质粒DNA，用BamHⅠ进行酶切验证。阳性质粒pcDNA3.1-3A4送立菲生物技术有限公司测序。

1.5CYP3A4启动子及CYP3A4*1G依赖的CYP3A4内含子10启动的真核表达载体的构建

用MluⅠ和NheⅠ双酶切重组质粒pcDNA3.1-3A4、PCR产物CYP3A4启动子及内含子10DNA片段，纯化回收测DNA浓度，16℃连接过夜。然后转化、筛选、提取质粒，质粒DNA用MluⅠ和NheⅠ双酶切验证。阳性质粒pcDNA3.1-P3A4(CYP3A4启动子重组质粒)、pcDNA3.1-W3A4(CYP3A4内含子10野生型重组质粒)和pcDNA3.1-M3A4(CYP3A4内含子10突变型重组质粒)送立菲生物技术有限公司测序，测序结果用DNAMAN软件与预期序列比对。

1.6重组质粒转染细胞中CYP3A4mRNA的检测

将按1.5方法构建的3种质粒及空质粒pcDNA3.1/Hygro(+)分别转染入HepG2细胞，48h后收集细胞，采用实时荧光定量PCR检测CYP3A4mRNA的表达水平。以GAPDH为内参，用ΔΔCT法计算CYP3A4mRNA表达水平。

1.7统计学

处理应用SPSS21.0对数据进行分析，4组间CYP3A4mRNA表达水平的比较采用单因素方差分析和LSD-t检验，检验水准α=0.05。

2结果

2.1构建的重组质粒的鉴定重组质粒pcDNA3.1-3A4的BamHⅠ酶切结果见图2，目的条带介于500bp与750bp之间。重组质粒pcDNA3.1-P3A4、pcDNA3.1-W3A4、pcDNA3.1-M3A4的MluⅠ和NheⅠ双酶切结果，目的条带介于1000bp与2000bp之间。酶切结果均与预期片段长度相符。测序结果显示均正确。

2.2转染细胞中CYP3A4mRNA表达水平的比较4种重组质粒转染的HepG2细胞中CYP3A4mRNA表达水平测定结果见表2。

3讨论

启动子一般位于基因的上游，能够与RNA聚合酶特异性结合从而启动转录。研究发现，一个基因的表达可以同时受多个启动子调控，且不同的启动子转录效率不同。有研究报道一些内含子具有启动子活性，可调控基因的表达。该课题组前期通过双荧光素酶报告基因研究发现，与药物代谢密切相关的CYP3A4基因，除了5'端启动子外，其内含子10也具有启动子功能，并具有CYP3A4*1G等位基因依赖性。基因的表达往往受多方面因素的影响，构建cDNA重组质粒并用于细胞转染可以排除其他调控序列对目的基因表达的干扰，从而有效地验证某一DNA片段或SNP对目的基因表达的影响。有文献报道将内含子嵌入真核表达载体，可通过测定外源基因的表达研究其功能。为验证CYP3A4内含子10是否对CYP3A4基因表达有影响，该研究构建了一系列真核表达载体。

重组质粒中的目的片段是否正确连入载体，需要经过测序验证。在测序之前往往先进行菌液PCR或酶切初步验证。菌液PCR在初筛过程中比较方便而且更为经济，但可能存在非特异性扩增，导致假阳性，不如酶切结果可靠。该研究采用酶切验证。值得注意的是，由于pcDNA3.1-3A4重组质粒构建完成后，XbaⅠ酶切位点前方5’端插入了两个碱基GA，形成了GATC序列，该序列能够被Dam甲基化酶识别，在腺嘌呤N6位置引入甲基，从而导致酶切受阻形成假阴性。为此，实验中进行BamHⅠ单酶切验证。由于pcDNA3.1/Hygro(+)空质粒与CYP3A4cDNA各有一个BamHⅠ酶切位点，CYP3A4cDNA插入EcoRV-XbaⅠ处后，二者相距686bp，用BamHⅠ酶切后电泳图上显示酶切结果介于500bp与750bp之间者为阳性。

细胞转染实验结果表明，CYP3A4内含子10能够有效地启动CYP3A4基因的表达，并存在CYP3A4*1G等位基因依赖性，CYP3A4*1G突变型(AA)启动子活性低于野生型(GG)。

总之，该研究成功构建了由CYP3A4启动子及CYP3A4*1G依赖的CYP3A4内含子10启动的CYP3A4真核表达载体，并从细胞水平进一步证实了CYP3A4*1G依赖的内含子10可启动CYP3A4mRNA的表达，为CYP3A4内含子10及CYP3A4*1G的功能与机制研究奠定了基础，为从内含子基因调控角度阐明CYP3A4酶活性的个体差异提供了新的理论依据。