Y染色体STR基因座的异常基因类型研究

Y染色体上有59373566bp的核苷酸，其中95%为非重组区域。该区域的遗传多态性位点构成了整个基因组范围内信息量最大、最稳定的单体型，反应男性个体间独特的遗传进化关系。在司法鉴定领域，用Y-STR可以直接确定男女混合斑中男性的Y单体型，而无需分离提取DNA，这使检测工作不仅简单而且非常有效。在Y-STR分型结果中额外基因的出现通常解释为多个体的混合物。本次研究意在探究更多的Y-STR遗传信息，为法医学鉴定提供依据。在研究中发现了11个标本的Y-STR存在异常分型结果，包括STR位点出现额外基因或基因缺失，报道如下。

1材料与方法

1.1研究对象

本实验室2010-2014年亲子鉴定案例。选择孩子为男性的案例，分成2组:“排除父子关系”的为1组，共49例，98个标本;“支持父子关系”的为1组，共252例，509个标本，其中有1家为3子，有3家为2子。除1家为壮族，其余均为汉族。从籍贯上分大部分为南方汉族。

1.2试剂与仪器

Chelex100(美国SIGMA，批号:SLBG4989V);AmpFlSTRYfilerTM试剂盒(美国AppliedBiosystems，批号:1405114);LIZ500(美国AppliedBiosystems，批号:1203321);PowerPlexY23system试剂盒(美国Promega公司，批号:0000144994);CC5ILS500(美国Promega公司，批号:0000130455);Hidi(美国AppliedBiosystems，批号:1209224);电泳缓冲液10хbuffer(美国AppliedBiosystems，批号:1306423);POP-4凝胶(美国AppliedBiosystems，批号:1406151)。PCR扩增仪(9700，美国GeneCompanyLimited);3130xlGeneticAnalyzer(美国AppliedBiosystems)。

1.3方法

1.3.1提取DNA采用Chelex方法，从外周抗凝血中提取DNA。

1.3.2PCR扩增使用AmpFlSTRYfilerTM试剂盒对Y染色体上的16个STR位点进行复合扩增，。

1.3.3PCR产物的电泳分析PCR产物通过ABI3130XL型测序仪电泳，毛细管长度为36cm，进样时间15s，进样电压1.5kv，PCR产物用量1.0μL，生成的数据文件用GeneMapperID-X软件分析(AppliedBiosystems，版本号:1.4)。

1.3.4重复验证分析结果中获得的异常基因型使用PowerPlexY23system试剂盒进行重复验证。

1.4异常基因型发生率的计算“支持父子关系”的1组以案例数计算(252例);“排除父子关系”的1组视为随机人群，以标本数计算(98个)。

2结果

2.1单体型和基因突变另文报道。

2.2异常基因型图谱在“支持父子关系”的1组标本中，除了单个基因的一步突变以外，有9个标本出现了异常基因型图谱。第1对父子，其DYS385基因座为三带型图谱(13，14，18)，其峰高比例约为1∶1∶2;第2对父子，其DYS385基因座为四带型图谱(13，17，18，20)，其峰高比例约为2∶1∶1∶1;第3对父子，其DYS385基因座为四带型图谱(13，18，19，21)，其峰高比例约为2∶1∶1∶1;第4对父子，其DYS439基因座为双基因图谱(12，13)，其峰高比例约为1∶1;第5对父子中儿子的DYS389Ⅱ基因座为双基因图谱(28，29)，其峰高比例约为1∶1，而其父该基因座的图谱正常，为单基因(28)。

2.3基因缺失的STR基因型图谱在“排除父子关系”的1组标本中有2个标本均在DYS448基因座发生了基因缺失。

2.4单基因座中出现多个基因和基因缺失的发生率分别为1.4%(5/350)、0.57%(2/350)。

2.5异常基因型的重复验证图谱。

3讨论

短串联重复序列(Shorttandemrepeat，STR)，由2-6个碱基构成核心序列，呈串联重复排列，因个体间重复次数不同而形成高度多态性。由于Y染色体在减数分裂时不与其它染色体发生重组，因此普通的Y-STR基因座呈连锁遗传，1个标本的某个基因座的分型结果只有1个基因(1条谱带)。在司法领域中，用Y-STRs确认男女混合斑中男性的DNA非常方便而有效，可以直接确定Y单体型而无需分离提取DNA。在Y-STR中额外基因的出现通常解释为多个体的混合物，因而在轮奸案中Y-STRs通常用于确定参与者的数量。

本文报道了9个标本的某个Y-STR基因座出现多个基因的异常分型结果。出现双基因的基因座有DYS439、DYS389Ⅱ;出现三带型和四带型的基因座为DYS385。国内亦有文献报道，在公安系统日常积累的标本中检测到3例DYS385出现三带型，而四带型未见报道。DYS439、DYS389Ⅱ基因座出现双基因在国外有报道，国内未见。DYS385具有较好的遗传多态性，也是1个很特殊的基因座，在常用的Y-STR基因座中只有它通常检测到2类结果——单基因型或双基因型。这是因为DYS385在Y染色体上有1个重复区域，序列分析显示除了点突变以外，这2个片段的侧翼区序列和重复单位没有系统差异，差别仅在于重复单位的数量。2个区域重复单位的数量相同时，我们检测到的是单基因;若重复单位的数量不同时即会检测到双基因。

此次研究中除去DYS385显示异常基因型的标本外，该座位双基因型与单基因型的比例约为43∶7(“支持父子关系”1组以案例数计算)。本文报道的3对父子除了DYS385基因座以外，其它15个Y-STRs基因座的检测结果均正常。3对父子的DYS385基因座检出三带型或四带型，可能是在减数分裂中染色体发生变异，增加了1段、2段甚至3段重复序列，导致DYS385的1对引物可以和3个、4个或5个基因座结合。DYS385基因座中都有1个基因峰的峰高约是其它基因峰峰高的两倍，这有可能是两个重复区域中串联重复序列的重复数量相同而产生的叠加效应。从文中3对父子的情况看，这种变异可以稳定遗传。本文报道了3个标本分别在DYS439、DYS389Ⅱ基因座出现双基因。这个观察结果最好的解释就是存在片段重复，从而使PCR引物与重复序列发生结合所致。DYS439、DYS389Ⅱ这两个基因座位于Y染色体的同一区域———无精子症因子a(AZFa)区域，该区域有780kb，包含9个已知的常用Y-STR基因座。Bosch和Jobling描述AZFa重复是作为两个10kb的人内源性逆转录病毒因子(HERVs)侧翼区域间重组的互惠产物。由于我们所用的STR检测方法不是确切地定量，在实际工作中对于增加的相对峰高难以确定，致使重复的区域中若STR核心序列的拷贝数相同，则难以确定重复的存在。这可能是双基因或多基因罕见报道的原因。

此次研究中发现有2个标本均在DYS448基因座发生基因缺失。基因缺失，往往考虑DNA模板降解所致。但在该标本中片段大小相近的座位(DYS389Ⅱ、DYS385、DYS392)均得到很好的扩增，这说明标本发生的分型缺失并非模板DNA降解所引起。PowerPlexY23system试剂的重复实验也证实了这点。基因缺失最可能的原因是Y染色体上该区域的序列发生了基因突变或基因转换，导致引物结合位置序列发生了改变。这需要重新设计引物测定该区域序列来研究证实。吴微微等报道基因分型缺失的发生频率为0.518%，在4477个标本中DYS458缺失发生1次，DYS456缺失出现了37次。未见DYS448发生缺失的报道。我们此次研究的基因分型缺失的发生频率为0.57%，与文献报道数据接近。

综上所述，Y-STR某基因座出现多基因与常染色体STR的三带型在发生机理上完全不同，它只是1个重复事件导致的结果。M.Diederiche等报道了更为罕见的案例，1位巴西的男性在16个Y-STRs中DYS437、DYS439、DYS389Ⅱ3个基因座均出现双基因。因此，在法医学鉴定中，双基因的存在是否意味着多个男性个体的DNA混合，需慎重地结合更多的Y-STR基因座结果来综合分析。

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